Контрольная работа по «Биофизическая химия »

Хроматография — метод  разделения смесей веществ или частиц основанный на различиях в скоростях  их перемещения в системе несмешивающихся  и движущихся относительно друг друга  фаз.

Колонка — содержит хроматографический сорбент, выполняет функцию разделения смеси на индивидуальные компоненты.

Элюент — подвижная  фаза: газ, жидкость или (реже) сверхкритический флюид.

Неподвижная фаза — твердая  фаза или жидкость, связанная на инертном носителе, в адсорбционной  хроматографии — сорбент.

Хроматограмма — результат регистрирования зависимости концентрации компонентов на выходе из колонки от времени.

Детектор — устройство для регистрации концентрации компонентов  смеси на выходе из колонки.

Хроматограф — прибор для  проведения хроматографии.

Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано на различной сорбируемости компонентов смеси. В процессе хроматографирования элюент, содержащий анализируемую пробу, перемещается через неподвижную фазу. Обычно неподвижная фаза представляет собой вещество с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа или жидкости, фильтрующейся через слой сорбента. При этом происходит многократное повторение актов сорбции – десорбции, что является характерной особенностью хроматографического процесса и обуславливает эффективность хроматографического разделения.

Качественный хроматографический анализ, т.е. индетификация вещества по его хроматограмме, может быть выполнен сравнением хроматограических характеристик, чаще всего удерживаемого объема (т.е. объема подвижной фазы, пропущенной через колонку от начала ввода смеси до появления данного компонента на выходе из колонки), найденных при определенных условиях для компонентов анализируемой смеси и для эталона.

Количественный хроматографический анализ проводят обычно на хроматографе. Метод основан на измерении различных  параметров хроматографического пика, зависящих от концентрации хроматографируемых веществ – высоты, ширины, площади  и удерживаемого объема или произведения удерживаемого объема на высоту пика.

В количественной хроматографии  применяют методы абсолютной градуировки  и внутренней нормализации, или нормировки. Используется также метод внутреннего  стандарта. При абсолютной градуировке  экспериментально определяют зависимость  высоты или площади пика от концентрации вещества и строят градуировочные графики  или рассчитывают соответствующие  коэффициенты. Далее определяют те же характеристики пиков в анализируемой  смеси, и по градуировочному графику находят концентрацию анализируемого вещества. Этот простой и точный метод является основным при определении микропримесей.

При использовании метода внутренней нормализации принимают  сумму каких-либо параметров пиков, например сумму высот всех пиков  или сумму их площадей, за 100%. Тогда  отношение высоты отдельного пика к  сумме высот или отношение  площади одного пика к сумме площадей при умножении на 100 будет характеризовать  массовую долю (%) компонента в смеси. При таком подходе необходимо, чтобы зависимость величины измеряемого параметра от концентрации была одинаковой для всех компонентов смеси.

Многочисленные методы хроматографии классифицируются по агрегатному состоянию фаз, механизму разделения и технике проведения разделения, по способу проведения процесса и т.д. (рис.5).

Рис.5. Классификация хроматографических методов.

 

Простота, эффективность  и универсальность хроматографического  метода обусловили широкое применение его для решения различных  вопросов химии, биологии, медицины, физики, биотехнологии, химической технологии и связанных с ней других областей промышленности и техники.

Кроме главного своего применения — качественного и количественного  анализа сложных смесей — хроматографические методы позволяют решать ряд других не менее важных задач. К ним относятся следующие:

• идентификация веществ и установление различия между ними;
• разделение сложной смеси на отдельные компоненты с препаративными целями;
• испытание вещества на однородность, на чистоту;
• очистка веществ от примесей;
• концентрирование вещества и его выделение из разбавленных растворов или смесей;
• контроль и автоматизация производственных процессов.

Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анализа атмосферы  планет Солнечной системы до полного  анализа содержимого одной живой  клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контроле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов производства. Хроматографический метод начинают применять для автоматизации технологических процессов. На каждом из 150 крупных заводов в России в технологическом контроле постоянно функционируют от 100 до 600 газовых хроматографов. Тысячи газовых, жидкостных и ионных хроматографов эксплуатируются в лабораториях Госсанэпиднадзора, экологических центрах, токсикологических лабораториях, и так далее.

Велико значение хроматографических методов в геологоразведке, в  частности, в поиске газоносных и  нефтеносных регионов как на суше, так и в морях, месторождений полезных ископаемых. Все чаще используется хроматография в энергетике для анализов воды на ТЭЦ и АЭС, для определения теплотворной способности природного газа.

Хроматографические методы незаменимы в контроле качества пищевых  продуктов.

Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находящихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника. Хотя явление, известное в настоящее время как ионный обмен, фактически было известно с середины прошлого века, широкое применение ионообменных процессов в практике началось после создания синтетических ионообменников — так называемых ионообменных смол  или ионитов. Используемые ранее естественные ионообменники (различные алюмосиликаты и другие соединения) не обладали достаточной воспроизводимостью свойств, не были химически устойчивыми и т. д. и поэтому существенного практического значения не имели.

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство с фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.

В качестве подвижной  фазы используют водные растворы солей  кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака, т.е. системы  растворителей, имеющих высокое  значение диэлектрической проницаемости  и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы.

Механизм ионного  обмена можно представить в виде следующих уравнений:

- для анионного обмена

X^- + R⁺Y^- ↔ Y^- + R⁺X^-

- для катионного обмена

X⁺ + R^-Y⁺ ↔ Y⁺ + R^-X⁺

В первом случае ион  образца X ^– конкурирует с ионом подвижной фазы Y ^– за ионные центры R⁺ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y⁺ за ионные центры R ^– вступают катионы образца Х⁺.

Естественно, что ионы образца, слабо взаимодействующие  с ионообменником, при этой конкуренции  будут слабо удерживаться на колонке  и первыми вымываются с нее  и, наоборот, более сильно удерживаемые ионы будут элюировать из колонки (рис. 6) последними. Обычно возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей образца с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно выделить «классическую» ионообменную хроматографию в «чистом» виде, и поэтому некоторые хроматографисты исходят из эмпирических, а не теоретических закономерностей при ионообменной хроматографии.

Ионный обмен –  процесс обратимый и стехиометричный. Отмечают следующие стадии ионного обмена: диффузия иона через раствор к иониту в пору смолы, реакция обмена с функциональной группой, движение противоиона наружу.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь  от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных  фаз в ионообменной хроматографии  применяют ионообменные смолы и  силикагели с привитыми ионогенными группами.

Детектирование в  ионообменной хроматографии осуществляют с помощью любого детектора, применяемого в жидкостной хроматографии. Наиболее универсален для ионных соединений кондуктометр, на применении которого основан вариант ионообменной хроматографии - ионная хроматография.

                  

Рис. 6. Катионообменный фильтр

 

Методы ионообменной хроматографии  используются преимущественно для  разделения ионов. Количественные определения  компонентов после разделения могут  быть выполнены любым подходящим методом. Ионообменные методы применяют  для определения суммарного содержания катионов или анионов в растворе и для анализа растворов чистых солей. Большое практическое значение имеет основанный на ионном обмене процесс деминерализации воды. Ионообменные процессы применяются также для переведения в раствор малорастворимых соединений (BaSO₄, AgCl и др.). Интенсивно разрабатываются электрохимические аспекты применения ионообменных смол. Специально для электрохимических целей изготавливают так называемые ионообменные мембраны.

 

 

 

 

 

4. Принцип разделения  биомолекул методом электрофореза.  Для определения молекулярной массы белков какой метод электрофореза используется, в каком геле, к какому заряду будут двигаться молекулы, как располагается в геле, какие молекулы будут двигаться быстрее.

 

Электрофорез – метод  разделения белков и нуклеиновых  кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Тиселиус за разработку метода электрофоретического разделения макромолекул был удостоен Нобелевской премии в 1948 году. Принципиальной основой всех электрофоретических методов является тот факт, что находящиеся в растворе молекулы, располагающие электрическим зарядом, под действием сил электрического поля смещаются в сторону противоположно заряженного электрода.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 7). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецилсульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода.

Скорость миграции вещества в среде с одной и той  же силой электрического поля, зависит  от размера частиц и их электрического заряда. В случае белковых молекул,

                                       

Рис. 7. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (в полулогарифмической системе координат).