Качественные реакции на белки и аминокислоты

Расстояние, пройденное нанесенным на бумагу соединением  в направлении движения растворителя, характеризуется величиной Rf (коэффициент подвижности) и определяется следующим отношением:

 

 

В стандартных экспериментальных  условиях эта величина является для  данного соединения постоянной и  соответствует его коэффициенту распределения. Чем больше различие в величинах Rf разделяемых веществ, тем лучше их разделение.

Хроматографирование на бумаге можно проводить восходящим и нисходящим способом. В первом случае разделение веществ происходит по мере движения растворителя под действием капиллярных сил вверх, во втором – под действием капиллярных сил и силы тяжести. Первый вид хроматографии из-за простоты используется чаще, однако скорость движения при нисходящей хроматографии значительно выше.

Для определения расположения аминокислот  после хроматографии бумагу высушивают, просматривают в ультрафиолетовом свете или опрыскивают раствором  нингидрина и нагревают.

Все операции с бумагой  проделывают тщательно вымытыми руками или в перчатках. В противном  случае после проявления на бумаге выступает много пятен, не относящихся  к аминокислотам, выделенным из биологического материала.

 

 Подготовка растворителя и хроматографической камеры

Для хроматографии используется специальная  или приспособленная стеклянная камера с плоским ровным дном. На дно камеры наливается бутаноловый растворитель в таком количестве, чтобы на дне камеры образовался слой высотой 7 – 10 мл. Он готовится смешиванием бутанола,  ледяной уксусной  кислоты и воды в соотношении 4:1:5. Жидкости помещают в делительную воронку, осторожно встряхивают и дают отстояться образовавшейся эмульсии. Нижний слой сливают через кран делительной воронки, а верхний слой используют для дальнейшей работы.

 

Разметка бумаги  и  нанесение на нее растворов

Берут лист хроматографической бумаги, соответствующий размерам хроматографической камеры. По высоте он должен быть на 1 см ниже верхнего края камеры, а по ширине – не касаться стенок камеры. На расстоянии 2 см от одного из узких концов листа бумаги простым карандашом проводят линию старта и на ней карандашом отмечают места нанесения аминокислот -  свидетелей и идентифицируемых аминокислот. На другом конце бумаге в центре иголкой прокалывают отверстие и пропускают через него нитку, с помощью которой лист бумаги будет закрепляться в хроматографической камере.  На этом же конце бумаги карандашом пишется фамилия студента.

 В  качестве аминокислот – свидетелей  берут смесь растворов аминокислот, например, лизина, глицина и фенилаланина. Для идентификации берут растворы тех же аминокислот, но приготовленных по отдельности и не подписанных (готовятся перед опытом лаборантом или преподавателем). Микропипеткой в одно отмеченное место наносят каплю смеси растворов аминокислот – свидетелей, а в другое – каплю идентифицируемой аминокислоты. Диаметр пятна не должен превышать 1 см. Бумагу держат на воздухе до полного высыхания пятен. В место, куда наносят идентифицируемую аминокислоту, можно нанести каплю раствора другой аминокислоты, но только после полного подсыхания первой.

Хроматографическую камеру ставят в отведенное место. Листок бумаги с нанесенными аминокислотами осторожно опускают в камеру с растворителем почти до дна и закрепляют листок в подвешенном состоянии с помощью нитки, концы которой можно закрепить кусочками пластилина. Растворителя в камере должно быть столько, чтобы он не касался нижнего края  пятен нанесенных растворов. Необходимо проследить, чтобы бумага нигде не касалась стенок камеры. Камеру сверху накрывают стеклом.  Хроматографирование проводят в течение нескольких часов до достижения фронтом растворителя верхнего края бумаги. После этого бумагу вынимают, карандашом отмечают фронт растворителя и оставляют сушить на воздухе.

 

Проявление хроматограммы и идентификация аминокислот

Высушенную хроматограмму проявляют под тягой раствором нингидрина, равномерно смачивая этим раствором ее поверхность. Для этого используют кисточку из ваты или пульверизатор. При проявлении нельзя класть хроматограмму на стол, она должна находиться «на весу». Нельзя браться за смоченную поверхность руками, остаются отпечатки пальцев. Пропитанную хроматограмму  помещают в сушильный шкаф на 15 мин при 70° C или держат ее над горячей плиткой до полного проявления.

 Аминокислоты обнаруживаются  в виде сине-фиолетовых пятен.  Идентификацию аминокислот проводят  по совпадению на хроматограмме положения анализируемых аминокислот и аминокислот-свидетелей.

Аминокислоты – свидетели будут  располагаться в следующем порядке: нижнее пятно соответствует лизину, среднее – глицину, верхнее –  фенилаланину. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, являются идентичными. Определение аминокислот можно осуществить и по значению Rf. Для этого измеряют  расстояние от линии старта до линии фронта растворителя (В) и расстояние от старта до центра  пятна идентифицируемой аминокислоты (А). Отношение А/В дает значение Rf для данной аминокислоты в данном растворителе. В справочной литературе содержатся сведения по коэффициентам Rf для многих веществ, разделяемых в различных системах растворителей (Справочник биохимика, с. 912). 

 

Оформление работы

Записывают в тетради порядок  выполнения работы с краткими пояснениями, рассчитывают  значения Rf для каждой аминокислоты, указывают, какая аминокислота находилась в анализируемом растворе, хроматограмму приклеивают в тетрадь.

Лабораторная работа № 5

 

Определение концентрации белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом

 

Реактивы и оборудование: Сыворотка крови, спирт для промывки призмы; рефрактометр, пипетка.

 

1. Юстировка Перед началом определения белка необходимо убедиться, что прибор настроен (отюстирован). Для этого нужно открыть рабочую камеру, на призму нанести несколько капель дистиллированной воды и осторожно закрыть.  Глядя в окуляр, с помощью измерительного винта установить шкалу на деление 1,333 (показатель преломления воды).  При этом в рабочем поле должны совместиться  граница светотени и точка пересечения диагональных линий. Если этого нет, то не изменяя показания шкалы, добиваются совмещения регулировочным ключом.

 

2. Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови нужно открыть рабочую камеру, насухо вытереть призму и нанести на нее 1-2 капли раствора исследуемого белка. Осторожно закрыть, чтобы не было пузырьков воздуха в окне и с помощью измерительного винта добиться совмещения  границы светотени и точки пересечения диагональных линий.

По шкале  отметить значение коэффициента преломления, согласно которому по таблице 1 найти процентное содержание белка. Сравнить полученный результат с нормативными показателями (табл. 1 приложений) и сделать вывод.

Таблица 1

Расчет содержания белка по показателю преломления

П  о к а з а т е л ь       п р е л о м л е н и я
с точностью до тысячной	с точностью  до десятитысячной
	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	К  о  н  ц  е  н  т  р  а ц и я       б е л к а ,  %
1,343	4,09	4,15	4,20	4,26	4,32	4,38'	4,44	4,50	4,55	4,61
1,344	4,67	4,73	4,79	4,64	4,90	4,96	5,02	5,08	5,13	5,19
1,345	5,25	5,31	5,37	6,43	5,48	5,54	5,60	5,66	5,72	'5,77
1,346	5,83	5,89	5,95	6,01	6,07	6,12	6,18	6,27	6,30	6,36
1,347	6,41	6,47	6,53	6,59	6,65	6,70	6,76	6,82	6,88	6,94
1.348	7,00	7,00	7,05	7,17	7,23	7,29	7,34	7,40	7,46	7,52
1,349	7,58	7,58	7,63	7,75	7,81	7,87	7,93	7,98	8,04	8,10
1,350	8,16	8,16	8,22	8,33	8,39	8,46	8,51	8,57	8,62	8,68 ,
1,351	8,74	8,74	8,80	8,91	8,97	9,03	9',09	9,15	9,20	9,26
1,352	9,32	9,32	9,38	9,50	9,55	9^61	9,67	9,73	9,79	9,84
1,353	9,90	9,90	9,96	10,08	10,13	10,19	10,25	10,31	10,37	10,43
1,354	10,4В	10,48	10,54	10,66	10,72	10,77	10,83	10,89	10,95	11,01
1,355	11,06	11,06	11,12	11,23	11,29	11,35	11,41	11,47	11,52	11,58

 

Лабораторная работа № 6

 

Определение концентрации белка колориметрическим

методом по биуретовой реакции

 

Реактивы и оборудование: набор реактивов для определения общего белка фирмы Ольвекс, спектрофотометр (ФЭК), пробирки, пипетки.

 

Опыт 1. В трех пронумерованных пробирках подготовьте пробы следующего состава:

Состав пробы	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Биуретовый реактив, мл	5,0	5,0	5,0
Сыворотка крови, мл	0,1
Калибратор, мл		0,1
Вода дист., мл			0,1

 

Пробы тщательно перемешайте и  инкубируйте при комнатной температуре  в течение 30 минут или  в 15 минут  при 37⁰С. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при λ=540 нм.

 

Расчет концетрации белка произвести по формуле:

  где

Где, С – концентрация белка, г/л

Е_пробы – оптическая плотность опытной пробы;

Е_{калибратора} – оптическая плотность калибровочной пробы;

70 – концентрация белка в  калибровочной пробе, г/л

 

Произвести расчет концентрации белка  в сыворотке крови, сравнить с  нормативными значениями (табл. в приложении) и сделать вывод.

 

Лабораторная работа № 7

 

Кислотный гидролиз нуклеопротеида

Лабораторная работа № 12

 

В колбу  Кьельдаля внести 30мл раствора нуклеопротеида, полученного из дрожжей, и добавить 30мл 10% H₂SO₄. Колбу закрыть пробкой с обратным холодильником и осторожно кипятить в течение часа. После этого содержимое колбы охладить и профильтровать.

Небольшую часть полученного гидролизата (фильтрата) отлить в пробирку и использовать для определения фосфорной кислоты.

Оставшийся гидролизат нейтрализовать щелочью и использовать для обнаружения белков, пентоз, азотистых оснований.

 

1. Обнаружение фосфорной кислоты.

В пробирку внести 0,5-1 мл кислого гидролизата, добавить 0,5-1мл реактива на фосфор (ванадат-молибденовый реактив). Появление желтого окрашивания свидетельствует о наличии фосфорной кислоты.

 

2. Обнаружение пентоз.

В пробирку внести 0,5-1мл нейтрализованного гидролизата, добавить равный объемреактива Фелинга. Содержимое пробирки перемешать и нагреть до кипения верхний слой жидкости. Появление красно-желтого окрашивания свидетельствует о наличии пентоз.

 

3. Обнаружение пуриновых оснований.

В пробирку внести 0,5-1 мл нейтрализованного гидролизата и добавить равный объем аммиачного раствора серебра. Появление хлопьевидного осадка свидетельствует о наличии аденина и гуанина.

 

4. Обнаружение протеинов.

В пробирку 0,5-1мл  нейтрализованного гидролизата, добавить равный объем 10% NaOH и 1-2капли 1% СuSO₄. Появление сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии белков.

Провести  визуальные наблюдения и сделать  вывод. Написать уравнение ступенчатого гидролиза нуклеопротеида, указать  ферменты.

 

  Лабораторная работа № 8

 

Качественные реакции на витамины

Реактивы и оборудование: Витамины: ретинол, эргокальциферол, токоферол, тиамин, рибофлавин, аскорбиновая кислота;  ледяная уксусная кислота, насыщенная сульфатом железа (II), концентрированная серная, соляная и азотная кислоты, раствор анилина в концентрированной соляной кислоте, бром в хлороформе (1:60), раствор хлорида железа (ΙΙΙ), раствор красной кровяной соли,  изобутиловый спирт, раствор сульфаниловой кислоты, 5% раствор нитрита натрия, 10% раствор карбоната натрия, металлический цинк, раствор метиленовой сини, 10% раствор соляной кислоты, штативы, пробирки, водяная баня, спиртовки, держатели для пробирок, флюороскоп.

Ретинол  - витамин А

Этот витамин относится к  жирорастворимым витаминам и  состоит из нескольких витамеров. Все витамеры являются производными каротинов и образуются только в организме животных

 

Опыт 1.  Реакция с серной кислотой

На предметное стекло нанести 1-2 капли масляного  раствора витамина А и добавить 1-2 капли конц. H₂SO₄. Появление сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии витамина А.

 

Опыт 2. Реакция Друммонда

2-3 капли раствора витамина А помещают в пробирку, быстро добавляют 1 мл хлороформа и 0,5 мл концентрированной  серной кислоты. Появляется красно-фиолетовое окрашивание, переходящее в красно-бурое.

 

Опыт 3. Реакция с сульфатом железа (ΙΙ)

2-3 капли раствора витамина А  помещают в сухую пробирку, добавляют  1 мл ледяной уксусной кислоты,  насыщенной сульфатом железа (ΙΙ), и несколько капель концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, быстро переходящее в красное.