Качественные реакции на белки и аминокислоты

количества  слабой уксусной кислоты ускоряет свертывание  белка при нагревании. Добавление к раствору белка нейтральных  солей в кислой среде облегчает  и ускоряет свертывание белков при  кипячении благодаря дегидратации белковых молекул.

В кислой среде диссоциация белка по карбоксильным  группам подавляется, молекулы заряжаются положительно, а в щелочной среде  подавляется ионизация по аминогруппам, белки заряжаются отрицательно. И  в том и в другом случае молекулы отталкиваются друг от друга, и осадок не образуется даже при кипячении.            

 

   

    Кислая среда             Нейтральная среда                   Щелочная среда

 

Опыт 2. Наливают в 5 пробирок по 2 мл раствора яичного белка. Раствор в первой пробирке нагревают. Осадок образуется до того, как раствор закипит. Произошла денатурация белка.

 

Опыт 3. Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок белка образуется быстрее, так как рН раствора близок  его ИЭТ.

 

Опыт 4. В третью пробирку добавляют 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты и несколько капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Осадок белка образуется быстро. В изоэлектрической точке и в присутствии соли денатурация происходит быстрее, чем в опыте 3.

 

Опыт 5. В четвертую пробирку добавляют 0,5 мл 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. В кислой среде все белковые молекулы заряжаются положительно, и осадок белка не образуется даже при кипячении.

 

Опыт 6. В пятую пробирку добавляют 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия и нагревают. В щелочной среде все белковые молекулы заряжаются отрицательно, и осадок белка не образуется даже при кипячении.  

 

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Белки при взаимодействии с концентрированными минеральными кислотами подвергаются необратимой денатурации и выпадают в осадок. В избытке серной и  соляной кислот происходит постепенное  растворение первоначально выпавших осадков. Избыток азотной кислоты  практически не растворяет осадка белка, поэтому для обнаружения белка в исследуемом растворе пользуются азотной кислотой.

Опыт 7. В три пробирки наливают по 2 мл концентрированной азотной, серной и соляной кислот. Затем осторожно по стенке добавляют в каждую пробирку по 1-2 мл раствора яичного белка. Наблюдают образование осадков белков на границе двух жидкостей. При перемешивании осадки, образующиеся при действии соляной и серной кислот, растворяются, а в растворе азотной кислоты осадка образуется еще больше.

Осаждение белков органическими  кислотами

Для осаждения белков часто используют органические кислоты, такие как  сульфосалициловая и трихлоруксусная. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки и не осаждает продукты распада белков и свободные аминокислоты, поэтому ею часто пользуются  для полного удаления белков из биологических  жидкостей.

Опыт 8. В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую несколько капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты, а в другую – несколько капель 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В обеих пробирках наблюдается образование осадков белка.

Осаждение белков солями тяжелых  металлов

Соли тяжелых металлов вызывают необратимую денатурацию белков, образуя с ними нерастворимые  в воде соединения. Но при избытке  некоторых солей происходит растворение  осадка за счет адсорбции ионов солей белковыми частицами. В результате белковые частицы приобретают заряд и вновь растворяются. Растворение осадков денатурированных белков в избытке солей тяжелых металлов называется адсорбционной пептизацией.

Способность белков образовывать с  солями тяжелых металлов нерастворимые  соединения  используется при отравлениях  этими солями, когда в качестве противоядия применяют молоко или  яичный белок.

Опыт 9. В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка. В одну добавляют несколько капель 10% раствора медного купороса, в другую – несколько капель 5% раствора ацетата свинца. В обеих пробирках белки денатурируют. При добавлении в пробирки избытка солей  наблюдается растворение образующихся осадков.

Осаждение белков фенолом  и формалином.

Опыт 10. Фенол и формалин вызывают необратимую денатурацию белков. В две пробирки наливают по 1 мл раствора белка. В первую добавляют 1 мл насыщенного раствора фенола, а во вторую добавляют 1 мл  раствора формалина. В пробирке, куда добавлен фенол, осадок образуется быстрее. 

Осаждение белков спиртом

Опыт 11. Спирт вызывает дегидратацию молекул белка, вследствие чего происходит снижение устойчивости белковых молекул и денатурация белка. В пробирку наливают 2 мл раствора белка и осторожно по стенке пробирки наливают этиловый спирт так, чтобы он наслоился на белковый раствор. На границе двух жидкостей можно наблюдать белое кольцо денатурированного белка. 

Оформление работы

Опыты с 1 по 6 приводят полностью с  объяснениями, а результаты опытов с 7 по 11 можно оформить в виде таблицы, в которой в первой колонке  указывают белок, который  используется в опыте, во второй колонке указывается  вещество, которое используется для  осаждения,  в третьей колонке  описываются наблюдаемые изменения, в четвертой – дополнительные замечания.

 

Лабораторная работа № 3

 

 Определение изоэлектрической  точки  казеина и желатина

 

Реактивы и оборудование: 0,1 М,  0,2 М и 1 М растворы  уксусной кислоты, 0,4 % раствор казеина в 0,2 М растворе ацетата натрия, 0,1 М раствор ацетата натрия, 1% раствор желатина, 96% этанол или ацетон, штативы, пробирки, фотоэлектроколориметр, кюветы, пипетки на 5 и 10 мл.

 

Изоэлектрической точкой белка  называется величина pH среды, при которой суммарный электрический заряд белка равен нулю. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы, нейтральные молекулы белка легко выпадают в осадок. Вследствие этого определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению pH раствора, при котором наблюдается наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок. Для получения растворов с различной величиной водородного показателя пользуются буферными растворами.   

 

Опыт 1. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7  сухих пробирок наливают последовательно реактивы в количествах (в мл), указанных в таблице 1.

                                                                                                  Таблица 1

№ пробирок	Уксусная кислота, 0,2 М р-р, мл	Вода, мл	0,4% р-р казеина в  0,2 М р-ре ацетата  натрия, мл	рН смеси
1	4,8	1,2	0,6	3,8
2	2,4	3,6	0,6	4,1
3	1,2	4,8	0,6	4,4
4	0,6	5,4	0,6	4,7
5	0,3	5,70	0,6	5,0
6	0,18	5,82	0,6	5,3
7	0,09	5,91	0,6	5,6

 

Растворы  тщательно перемешивают. Казеин –  гидрофобный белок,  не имеет водной оболочки, менее устойчив и поэтому  через 5-10 минут наблюдается помутнение растворов. Наибольшее помутнение наблюдается  в той пробирке, где рН соответствует  изоэлектрической точке казеина. 

Если  визуально определить пробирку с  максимальным помутнением не удается, следует использовать фотоэлектроколориметр. С помощью фотоэлектроколориметра нужно провести определение процента пропускания света (Т%) приготовленными растворами, мутность которых объясняется образованием осадков белков в виде стабильной суспензии.

Для этого  за 15-20 мин до работы включают прибор, в дальнее кюветное отделение  ставят кювету с дистиллированной водой, а в ближнее отделение ставят кювету с анализируемым раствором.  Сначала свет пропускают  через воду,  стрелку прибора с помощью грубой и тонкой регулировки ставят на 100% пропускания света. Потом против пучка света ставят кювету с анализируемым раствором, определяют и записывают показания  стрелки прибора (процент пропускания света).

Аналогичным образом определяют % пропускания  света во всех пробирках. Пробирка, в которой пропускание света  будет минимальным,  соответствует  изоэлектрической точке белка.

 

Опыт 2. Для определения изоэлектрической точки желатина в 6 сухих пробирок  последовательно наливают   реактивы   в   количествах (в мл), указанных в таблице 2.

Содержимое  каждой пробирки перемешивают и затем  во все пробирки медленно по стенке добавляют по 2 мл 96% этанола (или  ацетона). Желатин – белок гидрофильный, обладающий двумя факторами устойчивости: зарядом и водной оболочкой. Спирт  понижает устойчивость белка.

 

                                                                                                                       Таблица 2

№ пробирки	Вода, мл	Уксусная кислота, 0,1 М р-р  мл	Уксусная кислота, 1М р-р, мл	Ацетат натрия, 0,1 М  р-р, мл	Желатин,1% р-р, мл	рН среды
1	3,8	0,8	-	2,0	2,0	5,6
2	3,5	0,5	-	2,0	2,0	5,3
3	3,0	1,0	-	2,0	2,0	5,0
4	2,0	2,0	-	2,0	2,0	4,7
5	-	4,0	-	2,0	2,0	4,4
6	3,2	-	0,8	2,0	2,0	4,1

 

Через 30 минут определяют изоэлектрическую точку желатина. Она будет соответствовать  рН пробирки с максимальной степенью помутнения. В случае, если визуально определить пробирку с максимальной степенью помутнения не удается, можно использовать фотоэлектроколориметр для определения процента пропускания света.

Оформление  работы

Результаты  опытов представляют на графиках, на которых  по оси абсцисс откладывают значения рН, а по оси ординат откладывают  обратные проценту пропускания света  значения (1/Т). Максимум на графиках будет  соответствовать изоэлектрической точке казеина и, соответственно, изоэлектрической точке желатина.     

 

Примечание: Работу делали только с желатином

 

Лабораторная работа № 4

 

Разделение аминокислот методом

распределительной хроматографии  на бумаге

 

Реактивы и оборудование: Бутанол, ледяная уксусная кислота,  стандартная смесь растворов аминокислот-свидетелей лизина, глицина, фенилаланина, 0,1 М растворы фенилаланина, глицина, лизина, 1% раствор нингидрина в ацетоне или в 96% этиловом спирте, хроматографические камеры, хроматографическая бумага, фильтровальная бумага, микропипетки, делительные воронки, колбы или стаканы на 50 мл, цилиндры мерные,  линейки, ножницы, простые карандаши, иголки швейные, нитки, пластилин, стеклянные пластинки, сушильный шкаф или электрические плитки, пульверизатор или чашки Петри для проявления хроматограмм, таблицы со значениями Rf.

 

Изучение аминокислотного состава  различных биологических тканей представляет собой важную задачу. В настоящее время для анализа  аминокислот  с успехом применяются  различные виды хроматографии, в  том числе и распределительной.

Метод распределительной  хроматографии на бумаге используется для разделения смесей разнообразных  органических веществ, и основан  он на различной растворимости веществ в разных несмешивающихся растворителях.

Если  какое-нибудь растворенное вещество распределено между равными объемами двух несмешивающихся  жидкостей, то отношение его концентраций в этих двух фазах в состоянии  равновесия при данной температуре  называют коэффициентом распределения.

 

 

 

Разделение веществ происходит вследствие различия в распределении их между двумя жидкими фазами, одна из которых подвижна, а другая – нет. Хроматографическая  бумага  обладает свойством поглощать воду из воздуха и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей: она представляет собой неподвижную фазу. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствие с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге с растворителем и наоборот.