Качественные реакции на белки и аминокислоты

Лабораторная  работа № 1

 

Качественные реакции на белки  и аминокислоты

 

Реактивы, оборудование: 10% и 20% растворы гидроксида натрия, 1% раствор медного купороса, 0,5% водный раствор нингидрина, 1% раствор нингидрина в 95% растворе ацетона, конц. азотная и серная  кислоты, реактив Миллона, реактив Фоля, 0,1% раствор фенола, ледяная уксусная кислота, 5% свежеприготовленный раствор нитропруссида натрия, 0,2% спиртовой раствор α-нафтола, раствор  гипобромита натрия, крист. мочевина, 40% раствор мочевины, 0,01% раствор аргинина, 0,01% раствор тирозина, 0,005% раствор триптофана, раствор глиоксиловой кислоты,  1% раствор яичного белка, 1% раствор желатина, 10% раствор углекислого натрия, 1% раствор сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты (1:3), 5% раствор нитрита натрия; штативы с пробирками, держатели, спиртовки, стеклянные трубочки, пипетки.

 

Биуретовая реакция

 

Биурет – вещество, образующееся при нагревании мочевины и содержащее пептидные связи в молекулах. Если к раствору этого вещества добавить гидроксид натрия и несколько капель раствора медного купороса, то образуется продукт розового или сине-фиолетового цвета. Полученное окрашенное вещество называется биуретовым медным комплексом, а сама реакция получила название биуретовой.

 

          О                            О                         О             О

          ║                            ║                          ║             ║

Н₂N- С - NН₂      + Н₂N- С - NН₂ → Н₂N - С - N Н - С - NН₂    +    N Н ₃

 

    мочевина                                                              биурет     

 

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Биуретовый медный комплекс

 

Биуретовую реакцию могут давать все вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Раствор белка в щелочной среде при взаимодействии с ионами меди также приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты неполного гидролиза белков дают розовое окрашивание. И в этом случае происходит образование биуретового медного комплекса.

Интенсивность окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе, поэтому биуретовую реакцию можно использовать для определения концентрации белка в растворе.

Опыт 1. К 1 мл 1% раствора яичного белка прибавляют 1 мл 10% раствора гидроксида натрия, 2-3 капли 1% раствора медного купороса и все перемешивают. Раствор приобретает фиолетовую окраску.

 

Опыт 2. Небольшое количество кристаллической мочевины поместить в пробирку, расплавить над спиртовкой и продолжать нагревать в течение 1-2 минут. Пробирку охладить, добавить 1-2 мл дист. воды для растворения образовавшегося вещества и проделать с ним биуретовую реакцию. Раствор должен приобрести розовую окраску.

 

Нингидриновая реакция

 

Эту реакцию  дают все аминокислоты, пептиды, белки, имеющие в α – положении  аминогруппы. В результате взаимодействия α - аминокислоты с нингидрином образуется Шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и в присутствии воды расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден.

 

 

Аминодикетогидринден конденсируется еще с одной молекулой нингидрина. Образующееся соединение   после енолизации переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана». Если реакция протекает в среде с органическими растворителями (спиртом или ацетоном), то продукт этой реакции содержит в своем составе радикал исходной аминокислоты, который и обуславливает различную окраску этого продукта: голубую, красную, синюю, фиолетовую, а в присутствии пролина – желтую.

Эта реакция  с раствором нингидрина в ацетоне или спирте используется для идентификации аминокислот после хроматографии, для открытия отдельных аминокислот и для определения их количества.

 

Опыт 3. К 2 мл раствора белка добавляют несколько капель 0,5% водного раствора нингидрина и кипятят 1-2 мин. В пробирке появляется розово-фиолетовое окрашивание, а с течением времени раствор синеет.

 

Опыт 4. Аналогичную реакцию проделывают с раствором глицина и пролина, используя раствор нингидрина в ацетоне.

 

Ксантопротеиновая реакция

 

Этой  реакцией можно доказать присутствие  в белке ароматических аминокислот: триптофана, тирозина, фенилаланина. При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты появляется желтое окрашивание. Если к полученному раствору добавить щелочь, то окраска  переходит в оранжевую.

Ксантопротеиновая реакция не является строго специфичной. Так как она обусловлена нитрованием  ароматического ядра, то ее дают многие ароматические соединения, не являющиеся аминокислотами, например, фенол.

В щелочной среде нитропроизводные аминокислот  образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.

 

Опыт 5. В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного белка, а в другую – 2 мл раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 1 мл конц. азотной кислоты и нагревают. В первой пробирке образуется желтый осадок, а во второй – очень слабое окрашивание, так как желатин почти не содержит ароматических аминокислот. После охлаждения в каждую пробирку добавляют 20% раствор гидроксида натрия или концентрированный раствор аммиака до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли нитротирозина.

 

Реакция Миллона

 

Аминокислота тирозин, а также  белки, содержащие в своем составе  эту аминокислоту, взаимодействуют  с реактивом Миллона, (смесь нитратов и нитритов оксида ртути (I) и (II) в концентрированной азотной кислоте). При кипячении образуется кроваво-красный осадок ртутной соли динитротирозина. Белки, которые не содержат тирозина, такие как желатин, протамины, реакцию Миллона не дают.

                             

 

Опыт 6. Реакцию Миллона проделывают с тремя веществами: яичным белком, желатином и фенолом. В первую пробирку добавляют 2 мл 1% раствора яичного белка, во вторую – 2 мл 0,1% раствора фенола, в третью – 2 мл 1% раствора желатина. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора Миллона и осторожно нагревают. В пробирке с яичным белком появляется кроваво-красное окрашивание, в пробирке с фенолом – красное, а в пробирке с желатином жидкость бесцветна или слегка желтеет.

 

Реакция на слабосвязанную серу  (реакция  Фоля)

 

У белков, содержащих цистеин, при  нагревании в щелочной среде происходит гидролиз сульфгидрильных групп  с образованием сульфида натрия. Сульфид  натрия с плюмбитом свинца дает черный или бурый нерастворимый осадок сульфида свинца. Реакция протекает по уравнению:

 

В аминокислоте метионин сера связана прочно, поэтому  метионин в отличие от цистеина этой реакции не дает. 

 

Опыт 7. В пробирку налить 2 мл раствора белка и 2 мл реактива Фоля (к 5% водному раствору ацетата свинца добавляют 30% раствор гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка). Полученный раствор прокипятить, через 1 – 2 минуты появляется черный или бурый осадок сульфида свинца.

 

Реакция с нитропруссидом натрия

 

Эта реакция  также позволяет определить наличие  в белке цистеина, образующего  в сильнощелочной среде при кипячении ион серы. Раствор белка, содержащего цистеин, дает с нитропруссидом натрия красно-фиолетовое окрашивание. Интенсивность окрашивания зависит от количества аминокислот, содержащих серу, и от количества белка в растворе.

 

Опыт 8. К 2 мл 1% раствора яичного белка добавляют 2 мл 20% раствора щелочи, кипятят, а после охлаждения приливают 1 мл свежеприготовленного 5% раствора нитропруссида натрия, после чего появляется красно-фиолетовое окрашивание.

 

Реакция Сакагучи

 

Эта реакция  позволяет обнаруживать в белке  аминокислоту аргинин. При взаимодействии аргинина с гипобромитом в щелочной среде в присутствии α-нафтола гуанидиновая группировка аргинина окисляется гипобромитом и образуется продукт конденсации розово-красного цвета.

 

Образующийся нафтиларгинин может далее окисляться гипобромитом натрия с образованием соединения типа хинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп гуанидинового остатка и бензольного ядра α-нафтола.

 

Опыт 9. Опыт проделывают с яичным белком и со свободным аргинином. В первую пробирку добавляют 2 мл 0,01% раствора аргинина, во вторую – 2 мл раствора яичного белка. В обе пробирки добавляют по 2 мл 10% раствора гидроксида натрия и по 2-3 капли 0,2% спиртового раствора α-нафтола, хорошо перемешивают и приливают в каждую пробирку по 2 мл гипобромита натрия. Для стабилизации быстроразвивающегося розово-красного окрашивания можно добавить 1 мл 40% раствора мочевины.

Реакция на триптофан

Триптофан, реагируя в кислой среде  с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению:

По аналогичной  схеме протекает и реакция  триптофана с формальдегидом.

 

Опыт 10. В пробирку наливают 2 мл 0,005% раствора триптофана,  добавляют равный объем раствора глиоксиловой кислоты и 1 мл 0,04 М раствора сульфата меди. Осторожно по каплям прибавляют 2 – 3 мл конц. серной кислоты при охлаждении пробирки под струей водопроводной воды или во льду. Оставляют на 10 мин при комнатной температуре и ставят на 5 мин в кипящую водяную баню. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

 

Реакция Паули

 

При обработке  диазореактивом в щелочной среде гистидин и тирозин образуют окрашенное в оранжевый цвет соединение:                

 

Сульфаниловая кислота                    п-сульфобензолдиазоний

                                                         (диазобензолсульфоновая кислота)

 

Опыт 11. В одну пробирку вносят 1 мл раствора тирозина, в другую – 1 мл раствора белка. В каждую добавляют по 2 мл диазореактива. (готовится перед опытом, смешиванием в отдельной пробирке 1% раствора сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты и 5% раствора нитрита натрия в соотношении 1:3). После этого в каждую пробирку добавляют   10% раствор углекислого натрия до появления желтой или оранжевой окраски, которая постепенно становится все более интенсивной.                                                                                                         

Оформление  работы

Оформить работу следует в виде таблицы, в которой  привести название реакции, название определяемого вещества, уравнение реакции,  условия, при  которых следует проводить реакцию,  наблюдения и выводы.

 

 

 

Лабораторная работа № 2

 

Реакции осаждения белков

 

Реактивы и оборудование: раствор яичного белка, кристаллический сульфат аммония, насыщенный раствор сульфата аммония, 1% и 10% растворы уксусной кислоты, 10% раствор гидроксида натрия, концентрированные растворы соляной, серной и азотной кислот, 5% раствор трихлоруксусной кислоты, 20% раствор сульфосалициловой кислоты, 1% раствор медного купороса, 1% раствор ацетата свинца, насыщенный водный раствор фенола, раствор формалина, этиловый спирт, спиртовки пробирки, воронки, бумажные фильтры.

 

Высаливание белков сульфатом аммония

 

В водном растворе белков их частицы заряжены и гидратированы, что обусловливает  устойчивость белковых растворов. Но при  высокой концентрации солей, ионы которых  тоже гидратируются, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул, и снимается заряд с белковой молекулы адсорбирующимися на ней ионами солей. В результате этих двух процессов белковые растворы теряют устойчивость, частицы белка слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок.

 

Опыт 1. В пробирку наливают 1 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, встряхивают. Выпадает осадок глобулинов. Раствор фильтруют. Одну часть фильтрата нагревают до кипения и наблюдают свертывание альбуминов, находящихся в растворе. К другой части фильтрата добавляют кристаллический сульфат аммония до насыщения. Появляется муть или хлопья выпадающих в осадок белков альбуминов. Если понизить концентрацию солей добавлением дистиллированной воды, то осадок альбуминов вновь растворится. Объясняется это тем, что осаждение белков определенными солями является обратимым процессом.

 Из  приведенного опыта следует, что  для высаливания различных белков требуется разная концентрация одной и той же соли.

 

Свертывание белков при нагревании

 

Практически все белки при нагревании подвергаются денатурации. Но особенно быстро белки  денатурируют вблизи их изоэлектрических точек (ИЭТ), то есть при том значении рН, когда суммарный заряд молекулы белка равен нулю. В этих условиях на молекулах белков имеется равное количество отрицательно и положительно заряженных групп. Благодаря этому  белковые молекулы быстрее свертываются. ИЭТ яичных белков находится в  слабо-кислой    среде,    поэтому    добавление  к раствору  яичного белка небольшого