Химико-токсикологический анализ алкогольного опьянения

Количественному определению этилового алкоголя этилнитритным методом предшествует подготовка «укрепленных» дистиллятов, заключающаяся в нескольких повторных перегонках. 
Так, из 100 – 200 мл крови, растертой с хлоридом натрия, отгоняют сначала 300 мл дистиллята, затем дистиллят смешивают с раствором едкого натра и хлоридом натрия и отгоняют 200 мл дистиллята, в 20 мл которого после добавления 40 мл воды и производится определение этилового спирта.

Операции, связанные с определением ведутся в трех делительных воронках объемом 50 мл. В первую воронку помещают 5 мл очищенного четыреххлористого углерода, 10 мл дистиллята, 1 мл 5 н. раствора НСl и 2 мл 25% раствора нитрита натрия:

NaNO₃ + HCl = NaCl + HNO₂;

C₂H₅CH + HONO = H₂O + C₂H₅ONO

 

 

Этилнитрит экстрагируется четыреххлористым углеродом. Раствор этилнитрита в четыреххлористом углероде переносят во вторую воронку, содержащую 20 мл 0,1 н. раствора едкого натра, и встряхивают – происходит очистка от избытка окислов азота.

В третьей воронке раствор этилнитрата  в хлороформе встряхивают с 10 мл раствора виннокаменной и сульфаниловой кислот. Этилнитрат при этом омыляется и образуется соль диазония.

Слой органического растворителя удаляют, а к водному раствору диазотированной сульфаниловой  кислоты добавляют 10 мл солянокислого раствора α-нафтиламина. Содержимое воронки встряхивают – получается осадок или окрашивание вследствие образования азокрасителя:

 

Осадок растворяют в 5% растворе NаОН (25 мл), переносят в мерную колбу емкостью 250 мл, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки и фотометрируют или колориметрируют визуально, сравнивая окраску полученных растворов со стандартной шкалой.

Все операции экстрагирования, связанные  с количественным определением этилового  спирта этилнитритным методом, должны проводиться быстро и в герметически закупоренных делительных воронках.

Для приготовления стандартной  шкалы азокрасителя пользуются абсолютным эталоном или эталоном строго определенной концентрации по Х Государственной  фармакопеи. Берут 2,5 мл раствора, содержащего 2‰ (весовых) спирта, разбавляют его дистиллированной водой и проводят все стадии реакции образования азокрасителя.

Азокраситель растворяют в 25 мл 5% раствора NaOH, количественно переносят в мерную колбу емкостью 500 мл и объем доводят до метки водой. Стандартный раствор азокрасителя соответствует содержанию 0,01 мг этанола в нем. Из исходного раствора путем ступенчатого разбавления готовится стандартная шкала. Например 4 объема исходного раствора смешивают с одним объемом воды, что соответствует 0,008 мг/мл; 3 объема исходного раствора и 2 объема воды составят 0,006 мг/мл и т.д.

Расчет этанола в навеске  объекта исследования производится по формуле:

 

,

 

где С – это концентрация спирта в 1 мл стандартного раствора, выраженная в миллиграммах; V – общий объем раствора азокрасителя в миллилитрах анализируемой пробы; 60 – общий объем разбавленного дистиллята, взятого для количественного определения в миллилитрах; 10 – объем разбавленного дистиллята, взятого на определение в миллилитрах; 200 – общий объем второго дистиллята в миллилитрах; 20 – объем второго дистиллята, использованного для определения в миллилитрах; n – навеска объекта исследования в граммах.

 

Этилнитритный метод обладает высокой  чувствительностью и позволяет  определять десятые доли промилле этилового спирта. Ю.Г. Твалчрелидзе показал, что этилнитритный метод неприменим к исследованию дистиллятов, содержащих формальдегид. Метод трудоемок, связан с затратой большого количества исследуемого материала (до 200 мл крови). В судебно-медицинской практике метод применяется для исследования крови трупов.

 

2. Определение этилового спирта микрометодом Видмарка в модификации Шоймоша. Метод был разработан для определения этанола в крови живых лиц. В судебно-химических отделениях судебно-медицинских лабораториях Бюро судебно-медицинской экспертизы органов здравоохранения в исключительных случаях, когда на экспертизу доставлены не подвергшиеся гнилостному разложению очень малые количества крови или тканей трупа, допускается определение этанола микрометодом Видмарка в модификации Шоймоша. Полученные при этом результаты количественного определения могут иметь только относительное значение.

Принцип микрометода состоит в  том, что в колбе определенной конструкции спирт из взятой навески  крови отгоняют путем количеством смеси бихромата калия с концентрированной серной кислотой. Спирт вступает в реакцию с бихромтом калия, и окисляется до уксусной кислоты, а бихромат калия восстанавливается.

Исходя из количества бихромата  калия, взятого до анализа и оставшегося  неизмененным после реакции со спиртом, вычисляют количество его, пошедшее на окисление поглощенного из крови  спирта. Умножив это количество на соответствующий коэффициент, получают количество спирта, находящегося в исследуемом образце.

Способ позволяет определять наличие  спирта при содержании его в исследуемом  объекте в количествах 5‰ с  достаточной точностью.

Как и этилнитритный метод, метод  Видмарка – Шоймоша неспецифичен.

 

3. Фотометрический метод определения этилового спирта был предложен в 1954 г. Feldstein и Klendshoj. В СССР разрабатывался В.М. Колосовой и И.С. Карандаевым. Метод основан на ускоренной изотермической диффузии этилового спирта из объекта исследования (кровь, моча) под действием карбоната калия. Спирт восстанавливает бихромат калия в кислой среде; окраска последнего изменяется от светло-желтой до темно-синей.

По градации переходных оттенков фотометрированием  по отношению к эталонным растворам  этилового спирта и к контрольной пробе (дистиллированная вода) определяется содержанием спирта в объектах исследования.

Для фотометрирования используется универсальный  фотометр ФМ и фотоэлектроколориметры, работающие в видимой области  спектра. Определение проводится при  длинах волн 436 – 465 нм.

Количественному определению этилового  алкоголя фотометрическим методом  предшествуют качественные реакции  с растворами бихромата калия  в серной кислоте, перманганата калия  в воде и раствора мета-нитробензальдегида в серной кислоте. Применение трех реактивов-индикаторов повышает специфичность метода (по сравнению, например, с методом Видмарака – Шоймоша) и позволяет в кокой-то степени отдифференцировать этиловый алкоголь от метилового, пропилового, бутилового и изоамилового.

Метод достаточно точен (±0,2‰), позволяет проводить серийные анализы, требует затраты малых количеств объекта (по 2 мл крови и мочи), пригоден к исследованию крови и мочи как трупов, так и живых лиц. Метод нашел широкое применение в судебно-медицинской практике.

 

4. Ферментативные (энзимный) метод, или метод АДГ нашел применение в ряде зарубежный лабораторий. Сущность метода заключается в том, что алкогольдегидрогеназа (АДГ) катализирует окисление этилового алкоголя в уксусный ангидрид. Акцептором водорода в данной реакции является дифосфопиридиннуклеотид (ДРN), который в виде восстановленной формы адсорбирует в области длин волн 366 нм. С помощью стандартных растворов строят калибровочный график, а затем по измерений на фотометре экстинкции исследуемого раствора производят расчет концентраций алкоголя.

Метод точен (±0,1‰), специфичен, удобен при серийных определениях, однако требует специального оборудования, оснащения и специальных реактивов.

 

5. Определение методом газо-жидкостной хроматографии. Неоспоримыми преимуществами перед химическими методами определения этилового спирта обладает метод газо-жидкостной хроматографии – одного из современных видов распределительной хроматографии.

Определение этилового спирта этим методом является специфичным, сравнительно точным – чувствительность метода составляет 0,01%, объективным и доказательным. Газо-жидкостная хроматография позволяет разделить спирты – метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый и изоамиловый друг от друга в присутствии других летучих веществ, дать выделенным спиртам качественную и количественную характеристику.

Газовая хроматография, начав свое бурное развитие в 1952г., к настоящему времени добилась огромных успехов  при анализе органических веществ. В последнее время газожидкостная хроматография начинает широко применятся и в химико-токсикологическом анализе при исследовании на наличие летучих веществ: спиртов – метилового, этилового, пропилового и изоамилового, галогенпроизводных – хлороформа, дихлорэтана и др., ароматических углеводородов – бензола, толуола, ксилола, и др.

Сущность газохроматографического метода обнаружения и определения этилового (и других алифатических спиртов С₁ – С₅) заключается в переведении спиртов в алкилнитриты, которые затем подвергаются разделению на хроматографической колонке. разделенные на компоненты смеси спиртов поочередно поступают в детектор по теплопроводности – каторометр, сигналы которого регистрируются самописцем на бумажной ленте в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий в теплопроводности чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, выходящей в детектор из колонки.

Катарометр реагирует на присутствие  в анализируемой смеси практически  любого вещества.

Установление подлинности веществ проводится по времени удерживания алкилнитритов на хроматографической колонке. Время удерживания исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика

Расчет концентрации этилового  алкоголя производят с помощью метода внутреннего стандарта. Внутренним стандартом служит пропиловый спирт, а при его обнаружении а исследуемом объекте – изопропиловый спирт.

Токсическое значение и  метаболизм. При вскрытии трупа в большинстве случаев не обнаруживаются характерные изменения. Важными в диагностическом отношении признаками при судебно-медицинском исследовании трупа являются запах спирта от всех органов и тканей, особенно от мозга и легких, и данные химико-токсикологического исследования крови, мочи, а иногда и внутренних органов.

Введенный в организм спирт током  крови распределяется относительно равномерно по органам и тканям. Наибольшее количество спирта обычно содержится в крови, головном мозге  и органах, богатых кровью. Однако после всасывания в кровь около 90% этилового спирта окисляется до воды и угольного ангидрида по схеме:

 

Реакция эта протекает в печени

 

Этот процесс протекает главным  образом в печени, а также в  мышцах, почках, легких.

 

 

Только около 10% этилового спирта выделяется из организма в неизменном виде, причем около 7% легкими.

При гниении крови и других тканей животного организма происходит как «новообразование» этилового  спирта за счет превращения углеводов  крови, высших спиртов, бактериального распада белковых веществ и т. п., так и понижение его концентрации за счет окисления и улетучивания.

4. Амиловый спирт (изоамиловые спирты)

 

Качественное обнаружение. Если объект представляет собой спиртовый напиток, то40 – 50 мл его разбавляют водой до 10 – 15% содержания этилового спирта и извлекают 15 мл хлороформа. Хлороформную вытяжку делят на три равные части и исследуют реакциями.

В случае исследования биологического материала (внутренние органы трупа) дистиллят  повторно извлекают эфиром или хлороформом  и выпаривают при комнатной температуре. Обращают внимание на характер и запах остатка, а затем исследуют реакциями.

1. Часть остатка переносят (при малых количествах с помощью эфира и последующего удаления его) в пробирку и исследуют реакцией с салициловым альдегидом или ванилином в концентрированной серной кислоте – розово-красное окрашивание (реакция Комаровского). Этой реакцией удается обнаружить 1,5 мг изоамилового спирта в остатке, полученном после изолирования его перегонкой с водяным паром. Реакция неспецифична. Ее дают альдегиды и ряд органических веществ, летучих с водяным паром или дистилляции мочи и мозга, а также образуемых при контакте горячего водяного пара с каучуковыми пробками, трубками и т. д. Реакция может иметь только отрицательное значение.
2. Часть остатка смывают с помощью органического растворителя в пробирку и последний удаляют, не допуская нагревания. Остаток подвергают окисления раствором бихромата или перманганата калия в присутствии концентрированной серной кислоты при нагревании на водяной бане – развивается едва уловимый приятный запах изовалерианового альдегида, окисляющегося затем в изовалериановую кислоту с запахом «гнилостного сыра»; обнаруживается до 0,11 мг изоамилового спирта.
3. Часть остатка или каплю жидкости смешивают с 0,02 – 0,03 г высушенного ацетата натрия и с избытком концентрированной серной кислоты. При нагревании ощущается характерный фруктовый запах сложного эфира уксусной кислоты и изоамилового спирта, который определяется лучше, если продукт реакции вылить в холодную воду.

Токсикологическое значение. Изоамиловые спирты широко применяются в народном хозяйстве в качестве растворителей лаков, в производстве амилацетата, амилнитрита, валериановой кислоты, бездымного пороха. Уксусноамиловые эфиры, обладающие приятным запахом и известные под названием «грушевая эссенция», используются как растворители лаков для приготовления парфюмерных композиций.

имели место отравления искусственными эссенциями, содержащими сложные  эфиры амиловых спиртов.

Амиловые спирты рассматриваются  токсикологией как ядовитые вещества, обладающие сильно раздражающими и наркотическими свойствами. У человека при остром отравлении наблюдаются раздражения глаз и особенно дыхательных путей, головная боль, тошнота, рвота, поверхностное дыхание. Изоамиловый спирт обладает резко выраженным местным действием, вызывая при приемах внутрь некроз слизистой оболочки желудка, а также резорбтивным действием, поражая нервную систему и органы выделения. При отравлении амиловыми спиртами наблюдается также двойное видение, глухота, бред. В отдельных случаях наступает смерть. Симптомы отравления наблюдаются при приеме внутрь 0,5 г амиловых спиртов. Содержание 0,3% сивушных масел в спиртных напитках считается недопустимым. Смертельная доза при приеме внутрь изоамилового спирта составляет 10 – 15 г. При судебно-медицинском исследовании трупа серьезным наводящим указанием является специфический запах изоамилового спирта. Неоднократно наблюдались производственные отравления амиловыми спиртами. Изоамиловый спирт окисляется в организме медленнее, чем этиловый и медленнее выводится из него.