Фармакопейный контроль качества андрогенов и эстрогенов

 

 

Реакция с концентрированной серной кислотой.

Со стероидными соединениями протекает цветная реакция с концентрированной серной кислотой. Метилтестостерон и тестостерона энантат образуют при этом жёлто-оранжевое окрашивание с характерной зелёной флуоресценцией [7].

 

2. Представители эстрогенных гормонов

Этинилэстрадиол

По строению и действию этинилэстрадиол близок к эстрадиолу. Химически отличается включением этинилового радикала в положении С (17), что привело к повышению в несколько раз эстрогенной активности по стравнению с эстроном и сохранению ее при пероральном применении [8].

 

Этинилэстрадиол (Ethinylestradiol)

Физические свойства. От белого с кремовым оттенком до светло-кремового цвета мелкокристаллический порошок. Температура плавления 181 – 186°С. Удельное вращение от -27 до -31° (0,4%-ный раствор в пиридине). Практически нерастворим в воде, легко растворим в этаноле, растворим в хлороформе, ацетоне и диоксане [4].

Этинилэстрадиол применяется при гипофункции яичников, бесплодии, климактерических расстройствах, некоторых формах рака молочной железы, для подавления лактации [9].

 

Эстрадиола бензоат

Эстрадиол является естественным гормоном, так как образуется в организме женщины вместе с эстроном. В виде эфиров (бензоата) эстрадиол мало разрушается в тканях организма животного. Препарат медленно всасывается, медленно выделяется и оказывает длительное влияние на организм, его можно вводить относительно редко, с большими интервалами между инъекциями [7].

Эстрадиола бензоат (Estradioli benzoas)

 

Физические свойства. Белый или с желтоватым оттенком кристаллический порошок, без запаха, температура плавления 191—196°С. Плохо растворим в ацетоне, мало растворим в метаноле, в этаноле(95%) и в диэтиловом эфире и практически не растворим в воде [3].

Эстрадиола бензоат применяется при эстрогенной недостаточности в климактерическом периоде и при хирургической менопаузе по поводу незлокачественных новообразований, после лучевой кастрации; первичной и вторичной аменорее, гипоменорее, олигоменорее, дисменорее, вторичной эстрогенной недостаточности; гирсутизм при синдроме поликистозных яичников, вагините (у девочек и в старческом возрасте), гипогенитализме, бесплодии, слабости родовой деятельности, переношенной беременности, для угнетения лактации, при вирильном гипертрихозе у женщин; постменопаузном остеопорозе; раке молочной и грудной железы, раке предстательной железы, урогенитальных расстройствах (диспареунии, атрофическом вульвовагините, уретрите, тригоните), алопеции при гиперандрогенемии. Эстрадиолабензоат применяется также в качестве ЛС, стимулирующего гемопоэз у мужчин при остром радиационном поражении [5].

 

1. Общие физические свойства

По физическим свойствам лекарственные вещества представляют собой белые или со слабым кремоватым оттенком кристаллические порошки. Они практически нерастворимы в воде, очень легко, легко или умеренно (этинилэстрадиол) растворимы в хлороформе, умеренно или легко (этинилэстрадиол) растворимы в этаноле, умеренно или легко растворимы в эфире.

Производные эстрадиола отличаются друг от друга и других стероидных гормонов по удельному вращению, так как имеют в молекуле четыре ассиметричных атома углерода.

УФ-спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в смеси этанола и гидроксида натрия в области 220-330 нм имеет максимумы поглощения при 241 и 299 нм и минимумы поглощения при 226 и 271 нм, а раствор в этаноле — максимум поглощения при 280 нм. Этинилэстрадиол можно отличить по удельному показателю поглощения 0,005%-ного спиртового раствора при длине волны 280 нм. Он должен быть равен 65-69. Эстрадиола бензоат идентифицируют по УФ-спектру 0,01%-ного раствора в этаноле, который в области 220-350 нм должен иметь два максимума поглощения (при 269 и 276 нм).

Для данных веществ характерны поглощения света в ИК-области света. ИК-спектр испытуемого вещества, снятый в вазелиновом масле в области 3700-400 см-1, должен иметь полное совпадение с полосами поглощения прилагаемого к ФС рисунка спектра [7].

 

2. Общие химические свойства

Реакция с концентрированной серной кислотой.

С производными эстрогена протекает реакция с концентрированной серной кислотой. В присутствии этинилэстрадиола раствор приобретает оранжево-красную окраску с желтовато-зелёной флуоресценцией. После добавления полученного раствора к 10 мл воды окраска изменяется до фиолетовой и выпадает фиолетовый осадок. Эстрадиола бензоат под действием концентрированной серной кислоты гидролизуется с образование эстрадиола и бензойной кислоты. Последующее нагревание в присутствии этанола ведёт к образованию этилового эфира бензойной кислоты, имеющего характерный фруктовый запах.

Реакция с образованием бензоата этинилэстрадиола.

Наличие фенольного гидроксила в молекуле этинилэстрадиола подтверждают реакцией образования бензоата этинилэстрадиола, имеющего т. пл. 199-202°С [8]:

 

 

2. Определение примесей

 

К лекарственным веществам предъявляют многочисленные жесткие требования. Прежде всего, лекарственное вещество должно обладать высокой активностью, избирательностью и продолжительностью лечебного действия. Себестоимость его производства не должна быть слишком высокой. Наконец, оно должно быть доступным, а доходность при его реализации на фармацевтическом рынке - достаточно высокой. Оно должно быть нетоксичным и не должно вызывать нежелательных побочных эффектов. Кроме того, лекарственное вещество должно иметь высокую стабильность при хранении и быть высокочистым. Поэтому в контроле качества ЛС обязательно проводят исследования на чистоту. Основными источниками примесей являются: исходные и промежуточные продукты синтеза, сопутствующие вещества (в растительном и животном сырье), растворители, остатки кислот и щелочей, в том числе за счет выщелачивания стекла, металл, из которого изготовлена аппаратура, песок, асбест, волокна тканей и фильтровальной бумаги и т.д. Примеси можно разделить на две группы: технологические (внесенные исходным сырьем или образовавшиеся в процессе производства) и примеси, приобретенные в процессе хранения, транспортировки, под воздействием различных факторов (тепла, света, кислорода воздуха, влаги и др.).

Примеси могут быть токсичные (недопустимые), оказывающие влияние на фармакологический эффект, и примеси, указывающие на степень очистки ЛВ. Последние, присутствуя в больших количествах, снижают содержание биологически активных веществ и, соответственно, уменьшают активность ЛС. Поэтому в ФС (ФСП) указываются допустимые пределы содержания таких примесей и приводятся испытания, подтверждающие отсутствие токсичных примесей [7].

Согласно методике МФ для определения чистоты андрогенных препаратов применяют метод ТСХ, используя в качестве адсорбента силикагель Р2, а в качестве подвижной фазы смесь 90 объемов хлороформа Р и 10 объемов ацетона Р. Наносят отдельно на пластинку по 5 мкл каждого из двух растворов в этаноле (~750 г/л) ИР, содержащих: (А) 10 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 0,10 мг испытуемого вещества в 1 мл. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе до удаления растворителей и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм). Любое пятно, полученное с раствором А, кроме основного пятна, не должно быть более интенсивным, чем пятно, полученное с раствором Б. Кроме того, определяют потерю массы при высушивании (высушивают до постоянной массы при 105 °С; потеря составляет не более 10 мг/г) [10].

При сравнении с Японской фармакопеей следует отметить, что методики совпадают. Однако в фармакопее США, Европейской и Британской фармакопеях используется метод ВЭЖХ [11, 12, 13, 14].

Согласно методике МФ для определения чистоты эстрогенных препаратов применяют метод ТСХ, используя в качестве адсорбента силикагель Р1, а в качестве подвижной фазы смесь 92 объемов дихлорэтана Р, 8 объемов метанола Р и 0,5 объема воды. Наносят отдельно на пластинку по 5 мкл каждого из двух свежеприготовленных растворов в смеси 9 объемов хлороформа Р и 1 объема метанола Р, содержащих: (А) 20 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 0,20 мг стандартного образца эстрона СО в 1 мл. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, оставляют ее высыхать на воздухе до тех пор, пока не перестанет ощущаться запах растворителя, затем нагревают при 110°С в течение 10 мин и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Пятно, полученное с раствором Б, более интенсивное, чем любое соответствующее по положению и внешнему виду пятно, полученное с раствором А. Также определяют потерю массы при высушивании (высушивают до постоянной массы при 105 °С; потеря составляет не более 10 мг/г) [10].

Сравнивая с другими фармакопеями, следует отметить, что методики, описанные в МФ, совпадают с Японской фармакопеей. В фармакопее США, Европейской и Британской фармакопеях применяют метод ВЭЖХ [11, 12, 13, 14].

Таким образом, можно сделать вывод, что все рассматриваемые фармакопеи для определения примесей используют метод ТСХ и ВЭЖХ. И действительно методы жидкостной и тонкослойной хроматографии, которые характеризуются высокой чувствительностью и объективностью, являются перспективными для контроля чистоты лекарственных средств [15, 16].

 

3. Сравнительный анализ методик, используемых при идентификации веществ

В настоящее время фармацевтический рынок полон фальсифицированнх ЛС. Поэтому, чтобы не допустить некачественную продукцию в продажу  проводят идентификацию. В исследуемых фармакопеях приводятся различные методы идентификации данной группы ЛС [17].

 

3.1. Представители андрогенных гормонов

Метилтестостерон

Таблица 2 – Сравнительная характеристика методов идентификации метилтестостерона

Вещество	Лекарственная форма	НД	Методика
Метилтестостерон	Субстанция	МФ	ИК-спектрофотометрия ТСХ Температура плавленияоколо 165 °С
		JP-2006	Ультрафиолетовая и видимая спектрофотометрия ИК-спектрофотометрия Температура плавления 163- 1680С
		EP-2008	Первая идентификация: B. Вторая идентификация: A, C.
		BP-2009	Первая идентификация: B. Вторая идентификация: A, C.
		USP-24	ИК-спектроскопия УФ-спектроскопия Температура плавления 162 – 1670С

 

Идентификация метилтестостерона по МФ проводится по следующим методикам:

1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом метилтестостерона СО, илиспектру сравнения метилтестостерона.
2. Проводят испытание методом ТСХ, используя в качестве адсорбента кизельгур и импрегнируя пластинку в смеси 10 объемов пропиленгликоля и 90 объемов ацетона путем погружения ее на 5 мм ниже поверхности жидкости. После того как фронт растворителя пройдет не менее 16 см, вынимают пластинку из хроматографической камеры и выдерживают ее при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Используют импрегнированную пластинку в пределах 2 ч с момента приготовления, проводя хроматографирование в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 80 объемов циклогексана и 20 объемов толуола. Наносят отдельно на пластинку по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих: (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца метилтестостерона СО в 1 мл. Проводят хроматографирование до прохождения фронта растворителя на 15 см. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе до удаления растворителей, нагревают при 120 °С в течение 15 мин, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают при 120 °С в течение 10 мин. Дают охладиться и оценивают хроматограмму в дневном свете и ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б.
3. Температура плавления около 165 °С [10].

 

Идентификация метилтестостерона по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора метилтестостерона в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора метилтестостерона полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 1 – Спектр в УФ-области метилтестостерона

 

2. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения метилтестостерона, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром  высушенного метилтестостерона эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

 

Рисунок 2 – Инфракрасный спектр пропускания метилтестостерона

 

3. Температура плавления 163- 1680С [11].

 

Идентификация метилтестостерона по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: 162 ° C до 168 ° C.

В. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области спектра.

С. ТСХ.В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь безводной уксусной кислоты, петролейного эфира и бутилацетата(1:30:70). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 1 части метанола и 9 частей хлороформа, содержащих (А) 0,2г испытуемого вещества в 10 мл и (Б) 20 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл. После того как растворитель достигнет высоты более 2/3 от пластины, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм), а также путём опрыскивания насыщенным раствором дихромата калия в смеси 30 объемов воды и 70 объемов серной кислоты, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б [12, 13].

 

Идентификация метилтестостерона по фармакопее США проводится по таким же методикам, что и в Японской фармакопее (ИК- и УФ-спектроскопия). Температура плавления метилтестостерона по фармакопее США от 1620 до 1670С [14].

 

Тестостерона энантат

Таблица 3 – Сравнительная характеристика методов идентификации тестостерона энантата