Генна інженерія, як метод дослідження впливу змін у геномі людини

Корана запропонував методологію хімічного синтезу ДНК. Ним була

синтезована спочатку кодуюча частина аланінової т-РНК, а в 1976 році - ген

тирозинової т-РНК Е coli, який діяв при введенні в бактеріофаг.

Нині синтез гену можна здійснити автоматично за короткий час, але

необхідною умовою для цього є знання послідовності нуклеотидів. Але вчені

впроваджують й інші методи. Один з них передбачає використання фраґменту

зворотньої транскриптази, який спростував пануюче правило:

ДНК;РНК білок. Цей фраґмент деяких вірусів здатний синтезувати ДНК на

матриці РНК. Тому для синтезу гена необхідно виділити потрібну м-РНК, дати

в пробірку чотири дезоксирибонуклеотидтрансферази, зворотну

транскриптазу, іони магнію та   затравку. Фраґмент синтезує на матриці РНК

комплементарний ланцюг ДНК, після чого система обробляється лугом. Це

призводить до руйнування уже непотрібного ланцюга РНК. Надалі фраґмент

ДНК-полімераза відтворює комплементарний ланцюг, таким чином дослідник

отримує ген необхідного білка. Даний метод одержання генів має як переваги, так і недоліки. Серед незаперечних переваг - неперервність кодуючої послідовності. Еукаротичні гени складаються з кодуючих ділянок (екзонів), розміщених упереміш з некодуючими (інтронами). Синтез м-РНК на таких генах супроводжується вирізанням інтронів та подальшим сплайсингом кодуючих ділянок. Для цього необхідні певні ферменти. Однак кількість м-РНК різних видів, наявних у клітині, важко собі уявити. Виділення з цього різноманіття певної молекули - завдання важке.

       Допомагають ученим «зонди» - мічені радіоактивними атомами молекули ДНК довжиною 20-40 нуклеотидів. У багатьох випадках білок, який цікавить

дослідника, можна ідентифікувати і виділити в очищеному вигляді. Зовсім

незначної його кількості достатньо для визначення перших десятків

амінокислот послідовності білка, а отже, і синтезу ділянки кодуючої ДНК.

Введення такого зонду в суміш м-РНК легко знаходить потрібні молекули.

Труднощі відшукування необхідної м-РНК доповнюються недоліками

синтезованих генів, оскільки вони не вимагають регуляторних ділянок .

Другий шлях одержання генів - їх виділення безпосередньо з геномів за

допомогою рестриктаз. Це ферменти мікроорганізмів, які розрізають подвійну

спіраль ДНК у певних ділянках з 4-8 нуклеотидів. Дані ферменти

характеризуються специфічністю до послідовності, яку вони розпізнають. На

сьогодні відомо понад  500 рестриктаз, тому підбирати необхідний фермент

досить просто. Значну кількість рестриктаз, як кінцевих продуктів

біотехнології випускають компанії Sigma (США), Pharmacia (Швеція), Serva (Німеччина).

       Вектор-молекула ДНК здатна переносити в клітину чужорідну ДНК і

забезпечувати там її розмноження або включення в геном.

Вектор - найбільш важливий компонент процесу клонування. Вектори

повинні розмножуватись в клітині-господарі, і при введені чужорідної ДНК їх

функції не повинні істотно порушуватись. Для клонування ДНК

використовують різноманітні вектори-плазміди, віруси, фоли, які в звичайних

умовах є інструментом для перенесення чужорідної генетичної інформації.

Плазміди - малі молекули, які несуть по кілька генів. Ці позахромосомні

детермінанти спадковості є автономними структурами, що несуть   свою

інформацію у вигляді невеликої циклічної ДНК. До них належать статевий

фактор (F - фактор), фактори лікарської резистентності (фактор R), які

вивчаються з 1955 року.

       Вмонтовування чужорідного фраґменту ДНК в геном вектору проходить

в два етапи: спочатку ДНК вектора розрізається за допомогою рестриктаз, а

потім в них вмонтовується чужорідний фрагмент.

Розрізняють два типи фраґментів ДНК. Деякі з них мають на кінцях

структури, які здатні об’єднуватись - короткі гомологічні послідовності

нуклеотидів (липкі кінці), інші не мають таких структур (з тупими кінцями)

Такі хвости легко взаємодіють один з одним за принципом

комплементарності. Об’єднання фраґментів з тупими кінцями відбувається під

дією лігаз - ферментів. При комбінації різних рестриктаз і лігаз можна в будь-

якому місці розрізати ДНК і зшити її. Для зшивання фраґментів ДНК використовуються лінкери і адаптори.

       Лінкер - це синтетичний короткий дволанцюговий олігонуклеотид, що містить сайти розпізнання для ряду рестриктаз; він може бути приєднаний до кінців фраґмента ДНК, одержаної за допомогою якоїсь рестриктази, в процесі

реконструювання р-ДНК. Адаптор – це лінкер, що містить більш ніж один сайт

розпізнавання рестриктаз, він призначений для об’єднання фрагментів з

несумісними кінцями.При конструюванні векторів в них вводять гени-лінкери, що легко кодують ознаки, які розпізнаються, для виявлення і відбору наступних

трансформантів, і декількох сайтів розпізнавання різними рестриктазами з

метою одержання для клонування серії різних молекул ДНК .

      Отже, будь-яку доступну ДНК, в тому числі і людини, можна розщепити

за допомогою ферментів рестрикції на фраґменти і з’єднати їх з векторними

молекулами, які здатні проникати в клітини і далі існувати в них,

передаючись з покоління в покоління. Об’;єднані молекули також зберігають

цю здатність і називаються рекомбінантними ДНК. Кожна рекомбінантна

молекула складається з одного певного фраґмента ДНК і однієї векторної

молекули. Рекомбінантні ДНК вводять в клітину реціпієнт так, що в одну

клітину попадає одна рекомбінантна молекула. Далі ці клітини висівають на

тверде поживне середовище. Клітини виявляють розподілені на поверхні

окремо одна від одної. Кожна клітина починає ділитися і   дає багаточисельне

потомство, яке все зібране в тому місці, де попала вихідна клітина. Це

сімейство називається клоном, а назва самого процесу - клонування. Клон

можна ще більше розмножити і виділити з нього рекомдінантну ДНК. Таким

чином в процесі клонування відбувається поділ фрагментів вихідної ДНК і

створюється можливість одержати їх у великих кількостях, що забезпечує

основу для структурних досліджень цих фрагментів.

Фрагменти ДНК містять гени. Якщо одержана достатня кількість клонів,

то вони в сумі можуть містити всі гени, характерні для даної ДНК. Така сума

генів називається банком генів. Таки гени, що одержані з геномної ДНК

називають геномним банком. Окрім того, відкриття зворотньої транскрипції

дозволило створювати банки структурних генів, тобто тих послідовностей

нуклеотидів, які зчитуються і дають в клітині і-РНК, м-РНК. Ці банки

називаються бібліотеками комплементарних ДНК (к-ДНК). Використовуючи

спеціальні пройми в банку генів можна знайти клон, що містить ген, який нас цікавить.

 

       2.2.2 Картування геному і пренатальна діагностика

      Наступний етап пов’язаний з встановленням місця генів в хромосомах. Для генетичного розуміння хвороби важливо знати, де локалізований даний ген і як він розміщений відносно інших генів. Зміна цього порядку пов’язана з

патологіями. Картування генів дозволяє виявити деякі генетичні

захворювання. Нуклеотидні послідовності ДНК у різних людей часто

відрізняють один від одного деякими деталями. Завдяки цьому поліморфізму

ДНК при розщепленні однією і тією ж рестриктазою з ДНК двох індивідуумів

можна одержати фраґменти різної довжини. Відомо, що в кожній парі одна з

хромосом походить від батька, інша - від матері. Кожен власник набору

хромосом має нащадків, і його нащадок, в свою чергу, одержує по одній

хромосомі з кожної пари. Інший набір хромосом успадковується від матері. І

будь-яка індивідуальна хромосома приносить з собою специфічну картину

розподілу ділянок розщеплення рестриктазами.

       В багатьох випадках вдається пов’язати певний розподіл ділянок

рестрикції з генетичним захворюванням і простежити його передачу від

батьків до дітей, що дозволяє попередити генетичні захворювання шляхом

генетичних консультацій та дородової (пренатальної) діагностики.

До чого ж тут   генна інженерія? Наша ДНК складається з 3 109 пар

основ. В залежності від фраґменту можна одержати від 70 тис. до 10 млн.

фраґментів. Як розподілити фраґменти і визначити, які з них походять з

потрібної ділянки хромосом? Це завдання вирішується за допомогою клонованих фраґментів ДНК: суміш фраґментів піддають електрофорезу в плоскій пластинці агарозногогелю. Фраґментів так багато, що вони утворюють в гелі безперервну смугу.  Для того щоб знайти потрібний фраґмент використовуються генетичні

маркери, які являють собою клонований, денатурований і радіоактивний

фраґмент ДНК з потрібної ділянки генома. Серед безліч фраґментів

розрізняють ті, які містять послідовності з клонованої ділянки і визначають їх

довжину. Як же використовується ця методика в пренатальній діагностиці?

Прикладом є зчеплені зі статтю спадкові захворювання, в тому числі м’язова

дистрофія Дюшена. Ген, яким пов’язана хвороба, локалізується на Х-

хромосомі і є рецесивним. Тому хвороба проявляється тільки у чоловіків, а

жінки можуть бути лише носіями. Якщо чоловік здоровий, а жінка є носієм, то

син може народитись і здоровим, і хворим. Аналіз розподілу реструкційних

фраґментів з певної ділянки Х-хромосоми дозволяє виявити пошкоджений ген

в матері і у дитини. Це може бути виявлено пренатально, і батьки можуть

завчасно вирішити чи хочуть вони народити цю дитину. До цього мова йшла

лише про генетичний аналіз, не пов’язаний з локалізацією гена в хромосомі.

Генна інженерія дозволяє проводити і таку операцію: для цього попередньо

клонований і мічений радіоактивними ізотопами ген гібридизують зі

спеціально приготовленими препаратами хромосом. За допомогою

авторадіографії можна встановити, з якою саме хромосом і з якою її ділянкою

зв’язується мічений ген-зонд .

 

       2.2.3. Перспективи використання методу.

       Майбутнє генної інженерії основане на досягненнях молекулярної біології:

а) мутагенну активність певних хімічних сполук можна використовувати

для того, щоб викликати специфічні мутації в певних генних локусах;

б) у мікроорганізмів можлива передача генетичної інформації

нестатевим шляхом (трансформація або трансдукція). Аналогічні спроби

можна застосувати для еукаріот, включаючи людину;

в) дефектні гени можна замінити, використовуючи вірусні гени в якості

переносників;

г) в   геном людини можна ввести штучно синтезовані гени.

Деякі біологи висували претенціозні цілі маніпуляції генами. На їх

думку слід було створити людину з новими якостями. Якщо б, наприклад,

замінити шкіру голови або спини тканиною, що містить хлорофіл, то це б дало

індивіду здатність до фотосинтезу і вирішило б проблему нестачі їжі в світі.

Можливість клонувати людину зацікавила багатьох вчених. В книзі,

виданій у 1978 році, автори стверджували, що вегетативне розмноження

людини досягнуте. Одні писали, вегетативне розмноження людини дозволить

створити творчі особистості типу Моцарта, забуваючи, що генетичний

матеріал одного Моцарта не гарантує розвитку іншого. Навіть якщо б це стало

можливо, то ніяка б країна не погодилася б на подібне. Щоб клони повністю

реалізували свій потенціал, потрібні покоління.

       Ще один план про створення людиноподібних істот шляхом введення в

енуклевовані яйцеклітини генетичного матеріалу одержаного при злитті

клітини людини і людиноподібної мавпи. Такі гуманоїди призначалися для

виконання одноманітної роботи не викликали цікавості для нормальних

людей. Звичайно, висування різних гіпотез і обговорення планів корисно для