Изменение активности оксидоредуктаз в процессе ремедиации почв, загрязненных опасными ксенобиотиками

Расчёт активности дегидрогеназ производили по формуле

где С – концентрация формазана, найденная по калибровочной кривой; а – навеска почвы (1 г); Т – время инкубации (24 ч); 10 мл – объём формазана, используемый при построении калибровочной кривой; в – количество ацетона, пошедшее на извлечение формазана (7,5 мл). Для построения калибровочной кривой 2,5 мг ТФФ растворяли в 10 мл ацетона при нагревании до 30^оС на водяной бане. Концентрация полученного основного раствора 0,25 мг/мл. Раствор готовили непосредственно перед употреблением. Стандартные растворы ТТФ готовили из основного раствора, разводя его в 2, 5, 10, 20, 50 и 100 раз ацетоном. Для этого в градуированные пробирки помещали 5; 2; 1; 0,5; 0,2; 0,1 мл основного раствора ТТФ и доливали до 10 мл ацетоном. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и оставляли на 5 мин. Каждую концентрацию готовили в 3-4 повторностях. Интенсивность окраски рабочих растворов ТТФ, содержащих от 0,0025 до 0,1250 мг/мл вещества, измеряли на ФЭК с синим светофильтром (λ=440 нм), используя кювету толщиной 10 мм. Трифенилформазан (формазан: 2,3,5-ТФФ) получали следующим образом. 0,25 г 2,3,5-ТТХ растворяли в 2,5 мл дистиллированной воды. 0,6 г гидросульфита натрия (NaHSO₃) растворяли в 2,5 мл дистиллированной воды. Растворы сливали, после выпадения тёмно-красного осадка смесь фильтровали через стеклянный пористый фильтр и осадок промывали на фильтре дистиллированной водой до отсутствия реакции на хлориды (с 0,5%-ным раствором AgNO₃). Осадок (2,3,5-трифенилформазан) высушивали в сушильном шкафу.

 

2.1.3. Определение  активности каталаз в почве

 

Каталазную  активность измеряли с помощью титриметрического  метода Р.С. Кацнельсона и В.В. Ершова (Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии., 2005). Данный метод основан на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействии её с почвой по количеству неразложившейся перекиси, которое определяется перманганатометрическим титрованием.

 

Ход исследования

По 5 г почвы помещали в колбы ёмкостью 100 мл, заливали 25 мл 2%-ного раствора перекиси водорода и помещали в кювету с тающим льдом. Через 1 час из колбы отбирали 5 мл (при необходимости суспензию фильтровали через бумажный фильтр), смешивали с 5 мл 10 %-ной серной кислоты и титровали 0,1 н. раствором КMnO₄ до слабо-розовой окраски. Каталазную активность почвы выражали в миллилитрах 0,1 н. КMnO₄ за 1 час, которые представляли собой разность между контрольными и опытными определениями. Контрольные определения проводили аналогичным образом на навесках почвы, прогретых в термостате в течение 1,5 часа при температуре 160-170°С для инактивации ферментов.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки p<0,05 (95% доверительный интервал). Расчёт результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ  Microsoft Еxcel 2003 (for Windows XP).

 

 

1. Результаты и их обсуждение

2.2.1. Изменение дегидрогеназной активности почв, загрязненных тяжелыми металлами, глифосатом и нефтепродуктами

 

В исходной чистой почве активность дегидрогеназ составляла 1,118 мкл Н₂/г почвы за 24 ч. Через 2,5 месяца активность дегидрогеназ в этой почве снизилась в 2 раза (до 0,54 мкл Н₂/г почвы за 24 ч.), что может быть связано с уменьшением субстрата для дегидрогеназ при активизации микробных процессов в течение длительного летнего периода. Загрязнение тяжелыми металлами и глифосатом по-разному влияло на активность дегидрогеназ в почве. После внесения загрязнителей активность дегидрогеназ немного повысилась в варианте с кадмием и свинцом, что можно рассматривать как ответ почвенного сообщества на химический стресс. В почве с мышьяком она осталась на прежнем уровне. Внесение глифосата в почву снизило активность дегидрогеназ на 13%, что свидетельствовало об ингибирующем влиянии глифосата на почвенные дегидрогеназы.

 

Рис. 1. Динамика активности дегидрогеназ при загрязнении  тяжелыми металлами, мышьяком и  глифосатом.

 

Через 2,5 месяца фиторемедиации загрязненной кадмием и свинцом почвы, активность дегидрогеназ в ней снизилась на 30%. (Рис 1.) В то же время, она была выше, чем в чистой почве через 2,5 месяца эксперимента и приближалась к значениям в исходной незагрязненной почве. В почве с мышьяком, напротив, активность дегидрогеназ после фиторемедиации повысилась на 20% по сравнению с активностью дегидрогеназ в загрязненной почве до ремедиации и была выше, чем в контрольной чистой почве до и после ремедиции. Таким образом, используемые нами фиторемедиационные приемы стимулировали активность дегидрогеназ в загрязненной мышьяком почве. Из результатов некоторых ученых (Mikanova et al., 2001) известно, что кадмий оказывает минимальное ингибирующее действие на активность почвенных дегидрогеназ. Оценивая полученные нами результаты, можно сделать вывод о том, что комплексное загрязнение кадмием и свинцом со временем оказывает более выраженное ингибирующее действие на активность почвенных дегидрогеназ, чем загрязнение мышьяком, что связано, скорее всего, с известным кумулятивным действием тяжелых металлов.

При загрязнении  глифосатом в разных вариантах очистки  были получены различные результаты. В почве при культивировании сорго сахарного в сочетании со штаммом Agrobacterium sp. K3 активность дегидрогеназ после фиторемедиации была на 30% ниже, чем в загрязненной почве до ремедиации; в варианте: сорго сахарное и консорциум штаммов Acinetobacter sp. K7 с Agrobacterium sp. K3 активность дегидрогеназ, напротив, была, на 14% выше; в варианте с подсолнечником однолетним и штаммом Acinetobacter sp. K7 активность дегидрогеназ повысилась наиболее отчетливо по сравнению с загрязненной почвой до очистки – на 50% и была выше, чем в исходной чистой почве на 30%. Активность дегидрогеназ после ремедиации во всех вариантах превышала уровень в контроле через 2,5 месяца эксперимента. Таким образом, максимальная активность дегидрогеназ наблюдалась в варианте с подсолнечником однолетним и штаммом Acinetobacter sp. K7, она была выше по сравнению с другими вариантами в 1,9 и 1,3 раза, что свидетельствовало о преимуществах использования данной ассоциативной пары для стимуляции активности дегидрогеназ в загрязненной глифосатом почве.

Стимуляция  активности дегидрогеназ в загрязненной почве при культивировании растений происходит, на наш взгляд, благодаря  «ризосферному эффекту». Известно, что растения выделяют с корневыми экссудатами углеводы, спирты, аминокислоты, органические кислоты, витамины и т.п., вследствие чего в ризосферной зоне растений увеличивается численность микроорганизмов. Последние, производят ферменты, катализирующие разложение загрязнителей, в том числе, дегидрогеназы, пополняющие пул почвенных дегидрогеназ. (Cunningham S.D., Berti W.R., 1995).

Рис 2. Динамика активности дегидрогеназ при загрязнении  нефтепродуктами

 

  В почву, загрязненную дизельным топливом, высаживали растения: люцерну посевную и райграс пастбищный, загрязненную нефтешламом - люцерну посевную и сорго веничное. На стадии 7-10 сут. проростков в почву вносили микробную суспензию штамма-деструктора ПАУ Sinorhizobium meliloti P221. Дегидрогеназы катализируют реакции отщепления водорода, т.е. дегидрирования органических веществ, и выполняют функцию промежуточных переносчиков водорода, таким образом, они принимают непосредственное участие в разложении углеводородов. (Beyer L., Wachendorf C., et all., 1993.). Поэтому изменение активности дегидрогеназ в загрязненной углеводородами почве напрямую связано с биодеградацией углеводородов.  Через 2.5 месяца активность дегидрогеназ в почве, загрязненной дизельным топливом снизилась на 70%, а в варианте с нефтешламом упала в 6 раз, что говорит о высокой степени токсичности этих соединений. (Рис 2.)

Внесение в  почву дизельного топлива и нефтешлама незначительно влияло на активность дегидрогеназ. После 2,5 мес. фиторемедиации активность дегидрогеназ в варианте с дизельным топливом была на 12% выше, чем в этой почве до ремедиации и почти в 2,5 раза выше, чем в контрольной чистой почве через 2,5 месяца очистки. Эти результаты, коррелирующие с высокой степенью очистки почвы от дизельного топлива, которая составляла 88%, свидетельствовали об эффективности используемого растительно-микробного комплекса.

Установлено, что  из всех изученных нами загрязнителей  наибольшее токсическое действие на дегидрогеназную активность почвы  оказывает нефтешлам. Через 2 месяца эксперимента активность дегидрогеназ в нём снизилась в 6 раз.В почве с нефтешламом после ремедиации активность дегидрогеназ была значительно ниже, чем до ремедиации (в 3,5 раза), и в 1,6 раза ниже, чем в чистой почве. Таким образом, из всех изученных нами загрязнителей наибольшее ингибирующее влияние на активность дегидрогеназ оказал нефтешлам. Не смотря на используемые фиторемедиационные приемы (культивирование райграса и люцерны совместно со штаммом Sinorhizobium meliloti P221) активность дегидрогеназ в почве после очистки была низкой, что говорит о токсическом воздействии нефтешлама или его метаболитов на дегидрогеназы. Известно, что почвенные дегидрогеназы (Beyer L., Wachendorf C., et all, 1993.), ингибируются в наибольшей степени не самими углеводородами, а продуктами их деградации, которые могут аккумулироваться в почве и длительное время оказывать токсическое влияние, несмотря на снижение в почве содержания углеводородов.

 

2.2.2 Динамика каталазной активности в почве, загрязненной тяжелыми металлами, глифосатом и нефтепродуктами.

В исходной чистой почве активность каталаз до ремедиации составляла 2,9 мл 0,1 н КMnO4/час. (Рис 3.) Через 2,5 месяца эксперимента активность каталаз в этой почве увеличилась в 1,8 раза. Длительное нахождение экспериментальной чистой почвы в оптимальных условиях (температура окружающей среды 20-30^оС и регулярный полив) активизировало биохимические процессы в почве, что привело к образованию различных перекисей, являющихся субстратами для каталаз.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис 3. Динамика каталазной активности при загрязнении тяжелыми металлами, мышьяком и глифосатом.

 

Загрязнение почвы  нефтепродуктами, в отличие от тяжёлых  металлов и глифосата, где отмечалось ингибирование каталазной активности, способствовало увеличению активности каталаз в почве: с дизельным топливом – на 40%, с нефтешламом – на 50%, что можно рассматривать как ответную реакцию почвенного сообщества на химический стресс, а также как индукцию ферментативной активности субстратами для каталаз. Через 2.5 месяца в варианте с мышьяком активность каталазы снизилась на 60%, в варианте с глифосатом – на 20%. При загрязнении кадмием и свинцом активность каталазы снизилась в 2.5 раза, что свидетельствует о высокой токсичности этой группы элементов.

Через 2,5 месяц  фиторемедиации активность каталаз в почве с кадмием и свинцом была ниже, чем до ремедиации на 37%, что свидетельствовало о токсичном действии этих тяжелых металлов на каталазы. В варианте с мышьяком активность каталаз после ремедиации была выше, чем до ремедиации на 45%, соответствуя значениям исходной чистой почвы, что свидетельствовало о восстановлении активности каталаз, нарушенной под влиянием мышьяка, при использовании данного растительно-микробного сообщества.

Тяжелые металлы, как известно, блокируют сульфгидрильные группы белков, нарушая деятельность ферментов. Таким образом, показано, что совместное действие 2-х тяжелых металлов (кадмия и свинца) даже после фиторемедиации на основе растительно-микробного сообщества приводит к  ингибирующему влиянию как на каталазы, так и на дегидрогеназы.

Через 2,5 месяца фиторемедиации почвы с глифосатом наблюдались различные тенденции: при культивировании сорго и  штамма Agrobacterium sp. K3 активность каталаз снизилась на 8% по сравнению с активностью в загрязненной почве до ремедиации; сорго с консорциумом штаммов Acinetobacter sp. K7+ Agrobacterium sp. K3 – она увеличилась на 13%; в варианте с подсолнечником и штаммом Acinetobacter sp. K7 активность каталаз увеличилась на 63% и была вше, чем в исходной чистой почве на 35%. Выявленные тенденции по изменению активности каталаз соответствовали аналогичным в отношении дегидрогеназ. Таким образом, максимальная активность каталаз, как и дегидрогеназ, наблюдалась в варианте с подсолнечником однолетним и штаммом Acinetobacter sp. K7, она была выше, чем в других вариантах в 2,0 и 1,4 раза, что свидетельствовало о преимуществах использования данной ассоциативной пары.

Следует отметить, что активность каталаз во всех вариантах  загрязненной глифосатом и ТМ почвы  после ремедиации была ниже, чем в контрольной чистой почве в конце эксперимента, что подтверждало высокую ингибирующую способность тяжелых металлов и глифосата по отношению к каталазам.

 

 

Рис. 4. Динамика каталазной активности в почве, загрязненной дизельным топливом и нефтешламом.

     Загрязнение нефтепродуктами, в отличие от ТМ и глифосата, где отмечалось ингибирование каталазной активности, способствовало увеличению активности каталаз в почве: с дизельным топливом – на 40%, с нефтешламом – на 50%, что можно рассматривать как ответную реакцию почвенного сообщества на химический стресс, а также как индукцию ферментативной активности субстратами для каталаз (Рис.4). Через 2.5 месяца в варианте без растений активность каталазы колебалась в рамках доверительного интервала  при загрязнении дизельным топливом и снизилась в варианте с нефтешламом, что можно рассматривать как доказательство токсического действия данного ксенобиотика.

Через 2.5 месяца в варианте с дизельным топливом активность каталазы увеличилась на 5%, что, возможно свидетельствует об ответной реакции микробного сообщества на загрязнитель. В варианте с нефтешламом активность каталаз снизилась на 13%, что говорит о более выраженном токсическом действии нефтешлама по отношению к дизельному топливу.

После фиторемедиации активность каталаз в почве с дизельным топливом была выше, чем до ремедиации на 42%, с нефтешламом – на 27%. Таким образом, использованные нами фиторемедиационные приемы при обоих типах углеводородного загрязнения стимулировали активность каталаз в очищаемой почве, которая превышала активность в контрольной чистой почве до и после ремедиации. В случае дизельного топлива эта стимуляции был более выраженной, что свидетельствует в пользу его меньшей токсичности.

Сравнивая показатели активности каталаз в почве с различными видами загрязнителей, следует отметить, что в очищенной почве с нефтепродуктами активность каталаз была в 1,5-3,3 раза выше, чем при загрязнении ТМ и глифосатом. Известно, что каталазная активность является показателем активности аэробных процессов. Высокоактивный кислород, образующийся при участии каталаз, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах разложения углеводородов. Поэтому повышенная активность каталаз в почве с использованием растений может свидетельствовать об интенсивности очистки почвы от нефтяных углеводородов и служить критерием, характеризующим процесс фиторемедиации.