Изменение активности оксидоредуктаз в процессе ремедиации почв, загрязненных опасными ксенобиотиками

Время, требуемое для очистки загрязненной территории с помощью растений зависит от нескольких факторов:  
• видового состава растений и их плотности (численности);  
• типа и интенсивности загрязнения;  
• размера и глубины загрязненной области;  
• типа почвы и климатических условий;

Эти факторы, а значит, и скорость очисти почвы, могут сильно меняться в пределах одной загрязненной территории. Кроме того, плохая погода и поедание растений животными способны увеличить время очищения. Фиторемедиация не требует специального оборудования, рабочей силы и дополнительных затрат, поскольку большую часть работы выполняют растения. Этим объясняется и высокая экономическая выгода метода. Кроме того, растительность делает очищаемый участок более привлекательным. Для оценки эффективности технологии фиторемедиации используют различные методики, среди которых методы, основанный на определении активности почвенных ферментов является наиболее перспективным.

1.3. Приёмы биотестирования для оценки биодеградации загрязнителей в почве

Биотестирование представляет собой методический приём, основанный на оценке действия фактора среды, в том числе токсического, на организм, его отдельную функцию или систему организмов (Методы биотестирования…, 1989). По мнению некоторых авторов (Морозова А.В., 2000) биотестирование – это метод моделирования последствий воздействия фактора, обладающего общебиологическим действием на живое. Главная задача, решаемая биотестированием − это получение быстрого ответа – есть или отсутствует токсичность (Тарасенко, 1999). Ряд авторов (Евгеньев В.Н, 2001)  под биотестированием понимают приёмы исследования, при котором о качестве среды, факторах, действующих самостоятельно или в сочетании с другими, судят по выживаемости, состоянию и поведению специально помещённых в эту среду организмов – тест-объектов. Тест-объекты должны отвечать следующим требованиям:

1. Высокая чувствительность  к воздействиям даже малых  доз токсиканта.

2. Быстрота и экономичность  методов тестирования.

3. Воспроизводимость (возможность  получения аналогичных результатов  на этой же тест-системе).

4. Чувствительность не только к токсикантам, но и к их метаболитам.

5. Возможность экстраполировать  данные, полученные при исследованиях in vitro на условия in vivo (Дмитриева,  1991).

Биотестирование не отменяет систему аналитических и аппаратурных методов контроля природной среды, а лишь дополняет её качественно новыми биологическими показателями, так как с экологической точки зрения сами по себе результаты определения концентрации токсикантов имеют относительную ценность (Патин, 1981). Использование биологических тест-систем позволяет (Оливернусова К.Р., 1992) определить изменения в экосистемах на очень ранней стадии, когда они ещё не проявляются в виде морфологических и структурных изменений и их нельзя выявить другими методами. Это даёт возможность предвидеть нарушения экосистемы и вовремя принять меры. Кроме того, состояние биоиндикаторов можно использовать как дополнительную информацию при оценке здоровья населения.   Кумулятивный эффект (Егорова В.Н.,2000) всего многообразия сочетаний различных воздействий возможно оценить лишь с помощью биотестирования.

Тарасенко А.В. (1999) рассматривает биотестирование как введение в более тщательный и всесторонний анализ химического состава воды. Вопросам биотестирования загрязнённости воды поллютантами посвящены многие работы (Илющенко, 1994).

Биоиндикация – родственный  биотестированию приём, использующий для этих же целей организмы, обитающие  в исследуемой среде. При выборе таких организмов приходится соблюдать  определённые требования, среди которых  возможность фиксировать чёткий, воспроизводимый и объективный отклик на воздействие внешних факторов, чувствительность этого отклика на малые содержания загрязнителей и др. (Егоров, 1999).

Биоиндикацию можно проводить  на уровне молекул, клеток, органов (систем органов), организмов, популяций и даже биоценоза. Повышение уровня организации живой природы может приводить к усложнению, неоднозначности взаимосвязи биологического отклика с антропогенными факторами исследуемой среды, поскольку на них могут накладываться и природные факторы. Поэтому в качестве биотестов выбирают наиболее чувствительные к исследуемым загрязнителям организмы. Использование биохимических реакций (молекулярный уровень индикации) связано с тем, что они наиболее чувствительны к воздействию внешних загрязнителей. В присутствии загрязнителей окружающей среды, например, происходит уменьшение содержания хлорофилла в мембранах хлоропластов растений или понижается способность фитопланктона к продуцированию кислорода в процессе фотосинтеза. Это может служить индикаторным признаком воздействия на живую природу газопылевых выбросов предприятий или токсичных компонентов сточных вод (Евгеньев, 1999).

При проведении биологического тестирования на уровне организмов выбор биологических  переменных предполагает, что отклик должен коррелировать с изменениями на экосистемном уровне. Выявить такую зависимость на практике достаточно сложно. Однако такие показатели организмов, как рост особей, их продуктивность, выживаемость, состояние органов дыхания, состава крови и плазмы, удаётся использовать для биологического тестирования состояния среды (Евгеньев, 1999). Чувствительность отклика биотестов на содержание биологически активных веществ в испытуемой среде можно проиллюстрировать на примерах. Многие организмы способны аккумулировать (накапливать) химические загрязнители выше их естественного содержания в воде и почве без быстро проявляющихся нарушений. Такая способность тест-организмов оказалась полезной в качестве индикаторного признака загрязнения окружающей среды и используется для аккумулятивной биоиндикации. Этот приём биотестирования применяют при исследовании процессов миграции токсичных веществ в окружающей среде. В качестве тест-организмов выбирают те из них, которые имеют высокий коэффициент биологического накопления (КН) токсикантов из окружающей среды. Фитопланктон, например, имеет значение КН по тяжёлым металлам от 10² до 10⁴. Величина КН зависит от природных факторов. Бенз(а)пирен в гидробиоте Берингова моря накапливается с КН, равным 2,9×10³, а в тёплых водах Средиземного моря накопление возрастает в пять раз. Знание КН оказалось удобным для глобального и регионального мониторинга окружающей среды. Для оценки загрязнения природных вод кадмием можно использовать результаты анализа его содержания в водорослях, ПХБ Мирового океана – в жировых тканях морских млекопитающих, никелем Средиземного моря – в устрицах. Содержание ртути в почвах региона удобно отследить по накоплению токсиканта в капусте, галогенидов – по иглам сосны, лишайникам. Наконец, лучший индикатор загрязнения автострад свинцом и кадмием – подорожник, растущий вдоль них. Итак, несмотря на большое количество физико-химических методов диагностики состояния окружающей среды вопрос об использовании методов биотестирования остаётся открытым и требует детального рассмотрения вопросов применения конкретных тест-систем к конкретным случаям. Разработка систем биологического мониторинга – одно из важнейших направлений оценки состояния окружающей среды. Всё возрастающее загрязнение окружающей среды создает угрозу стойкого и необратимого изменения химического состава, физических, биохимических и микробиологических свойств почвы, определяющих её плодородие. Для оценки состояния почвы в изменённых и изменяющихся условиях окружающей среды основное значение приобретают не количественные характеристики загрязнений сами по себе, а их последствия.

В настоящее  время при биотестировании почв используют один или несколько тест-организмов. По мнению Кабирова Г.Р. (1997), для диагностики токсичности почв при биотестировании вначале необходимо разработать общие принципы и подходы и на их основе составлять многокомпонентные тест-системы, предназначенные для оценки токсичности почвенного покрова конкретного региона.

Илларионов А.К. (2003) изучали фитотоксичность нефтезагрязнённых почв. В качестве тест-объекта они использовали клевер луговой. Показателями фитотоксичности явилось снижение всхожести и выживаемости семян, а также вес сухой биомассы выращенных растений. Особое место занимает загрязнение почв ТМ. Этот вид загрязнения приводит у растений из нормальных местообитаний к изменениям активности ферментов

Вальков Е.Г.(1997) исследовал воздействие кадмия, цинка, меди, ртути и свинца при содержании их в чернозёме 1, 10, 100 ПДК на его фитотоксичность через семь суток, один и шесть месяцев после загрязнения. О степени фитотоксичности судили по всхожести, энергии прорастания, скорости прорастания, а также по длине корней, длине зелёных проростков, воздушно-сухой массе корней и зелёных проростков. В качестве тест- объекта использовали озимую пшеницу ввиду её широкого сельскохозяйственного применения.

В связи с  широким применением гербицидов в сельском хозяйстве в последнее время актуальным становится вопрос о стойкости этих веществ. Определение стойкости гербицидов происходит путём либо предварительной экстракции (Neururer, 1975; Неld, 1981), либо непосредственного подмешивания гербицидов или загрязнённой гербицидами почвы к определённым стандартным субстратам (Bouchet, Dagneaut, 1974; Gerber et al., 1975). В последнем случае затем производят посев или посадки тест- растений с последующей бонитировкой степени ущерба по внешнему виду или изменению биохимических процессов.

1.4. Активность ферментов в почве

В почву ферменты поступают из микроорганизмов, растений и почвенной фауны как в  качестве прижизненных выделений для выполнения определённых физиологических функций, так и после отмирания организмов при разрушении тканей и лизисе клеток и становятся неотъемлемым каталитически активным её компонентом (Хазиев, 2006). В результате иммобилизации ферменты в почве стабилизируются и длительное время сохраняют свою активность. В почве ферменты участвуют в важных биохимических процессах: синтезе и распаде гумуса, гидролизе органических соединений, остатков высших растений и микроорганизмов и переводе их в доступное для питание растений и микроорганизмов состояние, а так же в окислительно-восстановительных процессах, т.е. в основных звеньях почвообразовательных процессов. Часть этих ферментов подвергается протеолизу, другая часть связывается через различные механизмы (адсорбция, химические, ковалентные, водородные связи) с минеральными и органическими компонентами и формирует иммобилизованный ферментный пул почвы.

Общий ферментный пул почвы состоит из сложного комплекса источников по локализации, составу и состоянию ферментов. Выделяют следующие составляющие ферментного  пула в почве (Burns, 1982):

1. Ферменты, функционирующие внутри цитоплазмы живых микробных, животных и растительных клеток и осуществляющие основные метаболические процессы в них (гликолиз, цикл Кребса, окислительное фосфорилирование и др.). Так же к этой группе относятся все внутриклеточные ферменты грамположительных бактерий. Вне клетки эти ферменты не могут функционировать, так как они связаны с различными кофакторами и физиологическими функциями клеток. При выделении во внешнюю среду после смерти и разрушения клеток эти ферменты могут оставаться в активном состоянии и поступать в фонд почвенных ферментов.
2. Ферменты, находящиеся в периплазматическом пространстве живых грамотрицательных бактерий. При выделении через разрушающиеся клеточные стенки эти ферменты могут оказаться в различном состоянии: адсорбироваться или подвергаться протеолизу.
3. Ферменты, прикреплённые к внешней поверхности живых клеток, активные центры которых свободны и направлены наружу. Эти связанные с клетками ферменты обычно относят к внеклеточным. Сюда же относятся ферменты, находящиеся в бактериальных и внекорневых слизях.
4. Ферменты, выделяемые живыми клетками в течение нормального роста и деления, которые оказываются в жидкой фазе почвы. Они действительно внеклеточные ферменты, главным образом имеющие низкий молекулярный вес и продуцируемые обычно грамположительными бактериями, грибами и корнями растений. Их внеклеточная секреция связана с выполнением определённых функций: гидролиз высокомолекулярных или нерастворимых соединений; разрушение потенциально экзогенных токсинов; растворение ткани хозяина перед инвазией патогенна; растворение питательных соединений; стимулирование взаимоблагоприятных реакций с другими видами организмов. Часть этих ферментов может иммобилизоваться в почве.
5. Ферменты, внутри неделящихся клеток. Это – споры грибов, цисты протозоа, семена растений, эндоспоры бактерий.
6. Ферменты, связанные: а) внутри мёртвых клеток; б) с клеточными осколками. Постоянное поступление их в почву обеспечивает определённый уровень ферментативной активности, связанный с этими компонентами.
7. Ферменты, выделяющиеся из функционирующих клеток или из лизирующихся клеток. Первоначально эти ферменты локализованы и функционируют на поверхности или внутри клеток. В почвенном растворе могут сохраняться в течение короткого периода. К этой группе относятся многие гидролазы.
8. Ферменты, связанные временно в растворимые или нерастворимые фермент – субстратные комплексы.
9. Ферменты, которые адсорбированы на глинистых минералах на их внешней поверхности или внутри решетчатых структур силикатов. Ферменты, адсорбированные глинами, могут сохранить или не сохранить каталитическую способность.
10. Ферменты, которые связаны с гумусовыми коллоидами благодаря адсорбции, сополимеризации при образовании гумусовых веществ. Могут в течение длительного времени сохраняться в почве, отложениях и на суспендированных частицах в морской и пресноводных средах.

При интерпретации  показателей ферментативной активности почв, определяемых экспериментально, проблемой является установить, к  какой категории из указанных  составляющих общего ферментативного пула почвы относится эта активность. Дело в том, что распределение ферментов между различными группами локализации не постоянное, изменяется во времени и неодинаково для различных ферментов. Многие из этих групп представляют различные стадии «жизни» (функционирования) фермента в почве (Burns, 1982).

Для объединения  различных групп ферментов в  группы по их состоянию в почве  предложены следующие интегральные термины: для ферментов 5-10 групп  – «накопительные ферменты», в группах 4-10 – «абиотические» (не имеющие в данное время связи с живыми клетками организмов), для относящихся к группам 9 и 10 – «связанные в почве» или «иммобилизованные» ферменты. Эти три группы составляют потенциально активный и динамичный ферментативный фонд почвы и с некоторой условностью их можно назвать почвенными ферментами, определяющими ферментативную активность почвы (Burns, 1982).

Потенциальная активность специфических внутриклеточных  ферментов живых микробных клеток может быть оценена путём установления численности микробных популяций и определения максимальной каталитической способности их в почве проведением экспериментов с чистыми культурами и экстраполяцией результатов на общую биомассу в почве.

Почва подвергается интенсивному антропогенному влиянию  и служит одним из опасных звеньев циркуляции промышленных и сельскохозяйственных токсических веществ. Разнообразные химические реакции в почве, связанные с обменом веществ, разложением и синтезом органических веществ, миграцией химических соединений, мобилизацией питательных элементов и многие другие, осуществляются ферментативно. Высокая чувствительность, точность, относительная простота и нетрудоёмкость методов определения активности почвенных ферментов позволяют использовать их при оценке интенсивности и направленности важнейших для жизни и плодородия почвы биохимических процессов. По активности ферментов судят об агрономически значимых показателях, плодородии, превращении гумусовых веществ, окислительно- восстановительном режиме почвы. Активность ферментов отражает интенсивность основных биохимических процессов самоочищения почвы и разложения органических соединений азота, фосфора, углерода, а также степень эродированности и загрязнения почв (Коновалова и др., 1976). Биомониторинг и биодиагностика состояния и степени загрязнения почв по ферментативным показателям приобрели в последнее время особо важное значение (Краснова, 1982). Отсутствие стандартных, унифицированных методов определения активности почвенных ферментов затрудняет выявление возможности и области использования ферментов в целях биодиагностики и биомониторинга.