Изменение активности оксидоредуктаз в процессе ремедиации почв, загрязненных опасными ксенобиотиками

 

1.5. Использование показателей ферментативной активности почв для мониторинга процессов биоремедиации

Использование ряда ферментативных показателей при  оценке общей биологической активности и плодородия почвы является в настоящее время общепринятым (Хазиев, 1976). В качестве диагностического показателя загрязнения почв наиболее перспективными оказались ферменты класса оксидоредуктаз, в частности дегидрогеназы. Показана (Киреева, 2002) высокая корреляция активности дегидрогеназ в почве с активностью протеаз, интенсивностью процессов нитрификации, азотфиксации, дыхания, поглощением почвой кислорода и плодородием. Высокая чувствительность дегидрогеназ к химическим веществам используется (Киреева, 2002) при оценке токсичности почв, сточных вод промышленных предприятий. Все сказанное послужило основанием при выборе активности дегидрогеназ в качестве одного из диагностических показателей загрязнения почв (Киреева, 2002).

Учитывая то, что окислительно-восстановительные и гидролитические процессы в почве протекают сопряжёно и часть энергии, образованной в одних реакциях, используется в других, при биодиагностике почв необходимо проводить определение активности гидролитических ферментов. Особого внимания среди гидролаз заслуживает фосфатаза, с помощью которой осуществляется метаболизм фосфора в почве, и уреаза, с действием которой связано превращение азотсодержащих соединений в почве. Высокая чувствительность уреазы и фосфатазы к действию металлов, пестицидов, нефтепродуктов послужила основанием для выбора этих показателей в качестве индикаторов загрязнения почв (Киреева, 2002).

Продуцирование  углекислого газа является результатом сопряжёно протекающих гидролитических и окислительно-восстановительных процессов, которые в основном определяются биологическими факторами. «Дыхание» почвы, т.е. образование углекислого газа, используют как интегральный показатель, характеризующий действие оксидаз (дегидрогеназы) и гидролаз (фосфатазы и уреазы) (Киреева, 2002).

Многолетние исследования активности дегидрогеназы и каталазы при загрязнении почвы товарной нефтью и нефтепродуктами показали (Киреева, 2002), что окислительно-восстановительные реакции протекали более интенсивнее в загрязнённой почве, по сравнению с контрольной. Сырая нефть в течение длительного времени уменьшала активность каталазы, не влияла существенно на дегидрогеназную активность в полевом опыте и стимулировала её в лабораторном. Биодеградация и физико-химическое разложение углеводородов меняли со временем направленность окислительно-восстановительных реакций в почве, которые интенсивно шли во всех вариантах через 10 лет после загрязнения (Киреева, 2002). Изменение активности ферментов зависело как от состава, так и от дозы загрязнителя. Ароматические углеводороды ингибировали активность каталазы и дегидрогеназы. Циклогексан оказывали стимулирующее действие (Киреева, 2002).

 

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы  и методы

2.1.1. Условия  проведения микрополевого эксперимента, моделирующего процесс фиторемедиации почвы, загрязнённой нефтяными углеводородами, глифосатом и тяжёлыми металлами

В микрополевом эксперименте использовали почву, отобранную в Саратовской области, чернозём южный, суглинистый. Это – одна из почв, наиболее типичных для региона Саратовской области. Предварительный анализ почвы позволил получить основные характеристики (табл. 4), имеющие важное значение для планирования фиторемедиации.

Таблица 4.

Характеристика  почвы, используемой в микрополевом эксперименте по фиторемедиации

Тип	Чернозём южный, суглинистый
Гранулометрический  состав по фракциям, %: > 5 мм	1,8
5-3 мм	4,2
3-1 мм	10,0
1-0,5 мм	11,5
0,5-0,25 мм	19,0
< 0,25 мм	53,6
рН	7,20
Углерод органический общий, % к воздушно  сухой почве	0,9
P2O5, мг/кг	156
NO3-, мг/кг	6,30
NH4+, мг/кг	59,3

Таксономическая принадлежность почв приводится в соответствии с «Классификацией и диагностикой почв СССР» (1977) с учётом региональных особенностей (Болдырев, Пискунов, 2006).

Микрополевые  опыты проводили сотрудники лаборатории экологической биотехнологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов (г. Саратов) на экспериментальных площадках, каждая из которых была размером 1 м². Перед началом эксперимента почву перекапывали, разрыхляли, поливали и вносили загрязнители. В таблице 5 представлены концентрации загрязняющих веществ.

Учитывая широкий  диапазон углеводородного состава  нефтепродуктов, исследовали два типа загрязнения – нефтешламом и дизельным топливом в двух независимых экспериментах. Нефтешлам характеризуется большим содержанием высокомолекулярных ароматических углеводородов, гибридных (содержащих и ароматические и алифатические структуры) углеводородов и гетероциклических соединений. Используемый в работе нефтешлам отбирали из нефтешламонакопителя Саратовского НПЗ. Дизельное топливо представлено преимущественно углеводородами алканового ряда, а также нафтенами и низкомолекулярными ароматическими углеводородами. В работе использовали коммерческое дизельное топливо марки ДТ-Л.

Соли мышьяка, кадмия и свинца вносили в почву в виде растворов в концентрациях по металлу, которые соответствовали 15 ПДК. Для изучения мультизагрязнений растворы кадмия и свинца вносили на одну площадку.

Для исследования фиторемедиации почвы, загрязнённой глифосатом, загрязнитель вносили в составе широко распространённого гербицидного препарата «Раундап» (фирма «Монсанто»). В таблице 5 указаны варианты опыта.

После внесения загрязнителей почву выдерживали в течение трёх суток для равномерного распределения поллютантов и засевали семенами растений через 10 см между рядами. Все использованные в эксперименте растения представлены в таблице 5.

Таблица 5

Условия проведения микрополевого эксперимента

Вариант эксперимента	Загрязнитель/доза внесения в почву	Растения	Микроорганизмы
Контроль чистая почва	-	-	-
1	Pb(NO3)2 – 480 мг/кг почвы + CdCl2 – 7,5 мг/кг почвы	Подсолнечник  однолетний (Helianthus annuus L.) cорта «Саратовский 20» и суданская трава (Sorghum sudanense (Piper.) Stapf.) сорта «Саратовская 1183»	Штамм Aeromonas sp. MG3, устойчивый к тяжёлым металлам и мышьяку
2	Na3AsO4×12H2O – 50 мг/кг почвы	-//-	-//-
3	Глифосат – 540 мг/кг почвы	Сорго сахарное (Sorghum saсcharatum) сорта «Саратовское-35»	Штамм-деструктор глифосата Agrobacterium sp. K3
4		-//-	Консорциум штаммов- деструкторов глифосата Acinetobacter sp. K7 + Agrobacterium sp. K3
5		Подсолнечник  однолетний (Helianthus annuus L.) сорта «Саратовский-20»	Штамм-деструктор глифосата Acinetobacter sp. K7
6	Дизельное топливо  – 20 г/кг почвы	Люцерна посевная (Medicago sativa L.) и сорго веничное (Sorghum bicolor L. Moench)	Штамм-деструктор ПАУ и стимулятор роста растений  Sinorhizobium meliloti P221
7	Нефтешлам – 45 г/кг почвы	Люцерна посевная (Medicago sativa L.) и райграс пастбищный (Lolium perrene L.)	-//-

Посев семян растений проводили из расчёта: сорго веничное и сахарное – 5 г/м², райграс пастбищный – 3 г/м², люцерна посевная – 2 г/м², подсолнечник однолетний – 1,6 г/м², суданская трава – 5 г/м². Посевы поливали из расчёта приблизительно 20 л/м².

При очистке почвы от углеводородных загрязнителей на стадии 7-10-суточных проростков проводили бактеризацию растений путём внесения в почву микробной суспензии до ориентировочной конечной концентрации 10⁶ кл/г почвы. При очистке почвы от тяжёлых металлов пророщенные семена одного из опытных растений (суданская трава) обрабатывали микробной суспензией (10⁷ кл/мл) перед посевом растений Использованные в эксперименте бактериальные штаммы представлены в таблице 5.

Штамм Sinorhizobium meliloti P221 – деструктор полициклических ароматических углеводородов и стимулятор роста растений (депонирован с регистрационным номером B-9442 во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, г. Москва). Для получения рабочей суспензии штамма S. meliloti P221 микроорганизм культивировали до стадии позднего логарифмического роста в жидкой среде S следующего состава (г/л): маннит – 1,0; дрожжевой экстракт – 1,0; K₂HPO₄ – 0,2; KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; CaCl₂ – 0,02; рН 6,8. Для засева среды использовали 2-сут S-агаровую культуру штамма. По окончании культивирования 1 л культуральной жидкости с плотностью микробных клеток не менее 10⁸ кл/мл разбавляли водой 1:1 для приготовления рабочей микробной суспензии.

Для получения  суспензии штамма Aeromonas sp. MG3, который применяли для очистки почвы, загрязнённой мышьяком и комплексом тяжёлых металлов (свинец и кадмий), культуру выращивали в среде LB следующего состава (г/л): пептон – 10; дрожжевой экстракт – 5; NaCl – 5, до стадии позднего логарифмического роста. Биомассу отделяли центрифугированием, дважды отмывали 0,1 M фосфатным буфером (рН 7).

Для бактеризации растений, используемых при фиторемедиации почв, загрязнённых глифосатом, бактерии (табл. 5) выращивали на минеральной синтетической среде с глифосатом следующего состава (г/л): трис(гидроксиметил)аминометан – 6; NH₄Cl – 1,0; KCl – 0,2; MgSO₄×7H₂O – 0,2; микроэлементы мг/л: FeSO₄×7H₂O – 20,0; CaCl₂×2H₂O – 10,0 ; CuSO₄ ×5H₂O – 2,0; H₃BO₃ – 0,06; ZnSO₄×7H₂O – 20,0; MnSO₄×H₂O – 1,0; NiCl₂×6 H₂O – 0,05; NaMoO₄×2H₂O – 0,3.; суточную бактериальную культуру доводили водопроводной водой до нужной оптической плотности 1,0×10⁹ кл/мл и использовали для инокуляции семян или полива почвы из расчёта 50% от полной влагоёмкости.

Полив почвы  осуществляли по мере надобности, исходя из погодных условий. Длительность эксперимента составляла 60 дней.

Все варианты микрополевого  эксперимента исследовали в трёхкратной  повторности.

 

Определение убыли загрязнителей после фиторемедиации

Содержание  нефтешлама в почве до и после  выращивания растений, а также  в контрольном варианте без растений определяли гравиметрическим методом (Методика выполнения измерений гравиметрическим методом. ) с использованием предварительного фракционирования загрязнителя с помощью селективной экстракции и жидкостной колоночной хроматографии методом Полуниной и Кушина.

Определение концентрации дизельного топлива в почве проводили, экстрагируя загрязнитель из образцов четырёххлористым углеродом и анализируя содержание углеводородов в экстракте методом газовой хроматографии (Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов, практическое руководство). Измерение проводили на газовом хроматографе Shimadzu 2010 с использованием неполярной капиллярной колонки “Equty - 1” (Supelco, USA). Детектор – пламенно-ионизационный. Параметры детектора: частота обновления сигнала – 40 мс, makeup-газ – Не, поток Н₂ – 40,0 мл/мин, поток воздуха – 400,0 мл/мин, поток makeup-газа 30,0 мл/мин. Газ носитель – Не.

Определение исходных и остаточных концентраций тяжёлых металлов и мышьяка проводили на атомно-абсорбционном спектрометре iCE 3500 с пламенной и электротермической атомизацией и генератором гидридов, Thermo Scientific, в качестве источника света использовали лампы полого катода. Процесс разложения проб почвы в микроволновой системе «MARS Xprees» (США) осуществлялся в автоматическом режиме с постоянным контролем температуры.

Определение концентрации глифосата в почве проводили  с помощью газохроматографического анализа на газовом хроматографе Shimadzu 2010 с использованием капиллярной колонки Equty – 1 (Supelco, USA) и пламенно-фотометрического детектора (270^оС, Н₂ – 80 мл/мин, воздух – 120 мл/мин).

 

2.1.2. Методы определения активности почвенных ферментов

2.1.2. Определение активности дегидрогеназ в почве

 

Дегидрогеназную активность почвы определяли колориметрически по восстановлению субстрата, в качестве которого использовали бесцветное соединение 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ) (Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии., 2005) ТТХ, акцептируя мобилизованной дегидрогеназой водород, превращается в 2,3,5-трифенилформазан (ТФФ), имеющий красную окраску.

 

 

Ход исследования

По 1 г почвы  помещали в стеклянные пробирки и  приливали 2 мл 0,5% раствора ТТХ, тщательно перемешивали и помещали в термостат на 24 часа при 30^оС. После инкубации смесь снова тщательно перемешивали, давали отстояться в течение 10 минут, затем аккуратно удаляли пипеткой надосадочную жидкость. Для извлечения формазана, образовавшегося в процессе восстановления ТТХ, почву заливали 7,5 мл ацетона. Экстракцию проводили в течение 1 часа, перемешивая при этом несколько раз содержимое пробирок. Окрашенный экстракт отбирали и колориметрировали на ФЭК с синим светофильтром (λ=440 нм), используя кюветы толщиной 10 мм. В связи с тем, что нефтепродукты при экстракции из почвы растворителем окрашивают экстракт, что мешает определению интенсивности окраски, обусловленной ТФФ, мы использовали в качестве контроля стерильные почвенные образцы. По 1 г почвы помещали в стеклянные пробирки и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 180°С в течение 1,5 часов для инактивации ферментов. Все последующие операции проводили аналогично опытным образцам. Затем из значений экстинции опытных образцов вычитали значения экстинции контрольных (стерильных) образцов. Количество формазана рассчитывали по предварительно построенной калибровочной кривой и выражали в микролитрах водорода (мкл Н₂/г почвы) с учётом того, что на образование 1 мг формазана необходимо 150,35 мкл водорода.