Выделение секреторных гранул лимфоцитов

Надосадочную жидкость, в которой содержатся секреторные гранулы, отбирали для дальнейшей работы.

Электрофорез. Диск-электрофорез проводили в денатурирующих условиях (с ДСН) в 8% разделяющем геле.

Сначала собирали камеру для электрофореза (BioRad). Затем готовили 8% разделяющий гель по схеме:

Запасной раствор акриламида	5,5 мл,
дН2О	9,5 мл
Буфер для разделяющего геля (с 0,4% ДСН)	5,0 мл
ТЕМЕД	100 мкл
10% ПСА	100 мкл

 

Разделяющий гель заливали между стеклами камеры, не доводя до верха 2 см, и оставляли полимеризоваться 40 мин.

 

 

Готовили 4,5% концентрирующий гель по схеме:

 

Запасной раствор акриламида	1,0 мл,
дН2О	2,75 мл
Буфер для концентрирующего геля (с 0,4% ДСН)	1,25 мл
ТЕМЕД	50 мкл,
10% ПСА	50 мкл

 

Наносили концентрирующий  гель поверх застывшего разделяющего геля и вставили гребёнку. Оставили полимеризоваться 20 мин.

После полимеризации  устанавливали стеклянную камеру в аппарат для электрофореза, заливали камеру электродным буфером, убирали гребенку.

Образцы готовили по схеме:

Образец (1мг/мл) Х	50 мкл
Буфер для проб	5мкл
БФС	5 мкл

 

Пробы прогревали на водяной бане при 96^ОС в течение 3 мин, с последующим охлаждением до 20^О С.

Режим проведения электрофореза:

Вносили в кармашки по 20 мкл проб.

Электрофорез вели при постоянной силе тока. До входа образцов в Р.Г. – ток 20 мА, основной режим – 40-45 мА. Когда полоса БФС дошла до границы геля, электрофорез останавливали.

После электрофоретического разделения гель помещали в кристаллизатор, содержащий раствор 7% уксусной кислоты и 20% спирта (1ч – 24ч) для фиксации.

Окрашивание серебром. Гель отмывали четыре раза по 5 мин в б/дН₂О. Гель переносили на 20 мин в 50%-ный раствор этилового спирта, затем ополаскивали в течение 5 мин в б/дН₂О. Переносили в раствор 50%-ного спирта, содержащего 0,05% формальдегида, на 15 мин, отмывали 5 мин в б/дН₂О, вновь переносили в 50%-ный раствор этилового спирта, отмывали два раза по 5 мин в б/дН₂О. Воду сливали и гель заливали свежеприготовленным раствором аммиачного серебра. Для получения 100 мкл красящего раствора (0,36-0,4)г азотнокислого серебра растворяли в 50 мл б/дН₂О, добавляли 100 мкл 45%-ного NaOH и титровали до полного растворения коричневого осадка 10%-ным раствором свежеприготовленного аммиака (не более 2 мл !), доводили общий объем до 100 мл б/дН₂О. Окрашивание вели не более 15 мин при постоянном встряхивании, чтобы серебро не успело осесть на поверхность геля. Гель переносили в б/дН₂О и промывали пять раз по 1 мин. Заливали свежее приготовленным раствором проявителя, содержащим 0,038% формальдегида / 0,005% лимонной кислоты. Если белковые полосы не проявлялись, гель отмывали в 0.5% растворе красной кровяной соли, промывали в б/дН₂О, пока гель не станет прозрачным, и повторяли процедуру окрашивания серебром. Время появления полос (»6 мин). Гель промывали в б/дН₂О в течение 2 ч, сменяя воду каждые »5 мин.

 

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют  почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при  аллергических реакциях. [3] Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.

Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.

Основные методы выделения  лимфоцитов из периферической крови  основаны на центрифугировании гепаринизированной крови в градиенте плотности, что позволяет разделить клетки крови в зависимости от их плотности  и осмолярности. Первые методы разделения лимфоцитов включали использование фиколла в качестве агента для формирования градиента плотности, преимущество которого видели в отделении лимфоцитов от моноцитов. При этом получали популяции лимфоцитов с достаточно высоким уровнем чистоты. [11]

Мы выбрали методику, которая позволяла разделять  мононуклеарные клетки (МНК) и гранулоциты  периферической крови человека с  высокой степенью дифференцировки. Стандартная методика позволяет  легко получить фракцию МНК, но обычно небольшое количество гранулоцитов все-таки остается, так как есть различия в плотностях в группах МНК у различных образцов. Однако разделение может быть улучшено, подбором осмотической концентрации раствора. Авторы работы [12] показали, что например, использование фиколл-изопак при разделении лейкоцитов и гранулоцитов дает высокую степень очистки из крови человека.

Секреторные гранулы из лимфоцитов выделяли методом  описанным в работе [13,14] используя градиент плотности перколла. Особенности работы с ультрацентрифугой:

1. Ротор перед употреблением необходимо охладить, т.е. выдержать в холодильнике при температуре центрифугирования.
2. Пробирки с образцами тщательно уравновесить на электронных весах до четвертого знака после запятой.

Немаловажную роль при  патологии отводят нуклеазам  лимфоцитов.

Ранее было показано, что  лимфоциты крови пациентов с  астмой имеют характерные морфологические  изменения структурных компонентов. Эти изменения являются результатом  биохимических реакций.

По данным литературы [15] описана экспрессия ДНКазной активности (это кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Ca²⁺ и ингибируется Zn²⁺, специфична к днДНК) ассоциированной с цитоплазматическими гранулами в активированных CD4+-лимфоцитах человека и участие этих Т-клеток в развитии аутоиммунных заболеваний, что натолкнуло нас на изучение возможного присутствия гранул-ассоциированных ДНКаз в Т-лимфоцитах крови не только пациентов с астмой, но и здоровых людей.

Для этого нам и  надо было освоить метод и выделить гранулы из лимфоцитов. В результате была получена фракция , содержащая гранулы, из которой были экстрагированы белки.

Чтобы убедиться, что белки присутствует в белковом экстракте гранул, выделенных из лимфоцитов, мы провели электрофорез (рис.3) и определили их молекулярную массу.

 

 

 

1         2         3

1 - белковый экстракт гранул на интермитирующей стадии; 2 - белковый экстракт гранул на персистирующей стадии; 3 - маркеры : 68кДа-БСА, 45кДа- ЯА, 29кДа-  карбоангидраза: (окрашивание нитратом  серебра);

Рис.3. Электрофореграмма  белков гранул лимфоцитов в полиакриламидном геле.

Дорожки 1 и 2 – образцы  экстракта гранул, 3 – маркеры.

 

Молекулярные массы белков из секреторных гранул составляют: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.

 

 

ВЫВОДЫ

1.Освоен метод скоростного и равновесного центрифугирования.

2.Освоена работа на ультрацентрифуге Beckman Optima ^TM L-series.

3.Освоен метод выделения экстракта секреторных гранул Т-лимфоцитов.

4.Освоен метод определения молекулярной массы белков и установлена молекулярная масса белков секреторных гранул Т-лимфоцитов: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease/ D. Urboniene, R. Sakalauskas, B.  Sitkauskiene // Medicina(Kaunas). - 2005. - V. 41, N. 3. - P.190-195.
2. Kopinski, P. Apoptosis of alveolar lymphocytes in sarcoidosis and in control group is more frequentin smokers then in nonsmoking persons/ P. Kopinski, G.Przybylsk., B.Balicka-Slusarczyk et al//Przegl Lek.-2006.-V.63.-P.841-847.
3. vignola, a.m. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma/ a.m. vignola, p. chanez, a.m. campbell, et al. // am j respire crit care med.- 1998.-v.157.- p.403-409;
4. Ccылка на источник инет
5. Фармация Файн Кемиклз. Каталог продукции 1983. – С.-71-76.
6. Ccылка на инет
7. Остерман, Л.А. Методы изучения белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование.
8. Невзорова, Т.А. Физико-химические методы в биохимии. 2005 г
9. Ссылка на зи
10. Parrish, J.Z. Cuts can kill: the roles of apoptotic nucleases in cell death and animal development / J.Z. Parrish, X. Deng // Chromosoma. – 2006. - V. 115, № 2. - P. 89-97.
11. Feucht, HE. Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll)/HE.Feucht, M.R.Hadam, F.Frank, G.Riethmuller .// J Immunol Methods..-1980.-V.38.-P.43
12. Boyum, A. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality/ A. Boyum, D. Lovhaug, L. Trasland et al. //Scand. J. Immunol.-1991.-V.34.-P.697-712.

 

.

13. Podack, E.R. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural., biochemical and functional characterization/ E.R. Podack., P.J. Konigsberg//J.Exp.Med..-1984.-V.1.-P.695-710
14. Kornberg, A. Supplement to DNA replication / A. Kornberg/ - San Francisco: W. H. Freeman & Co, 1982. - P. 1-203.
15. Pio, R. Granule associated DNase in T4 and T8 lymphocytes from patients with autoimmune diseases / R. Pio, A. Gonzalez, M. J. Lopez-Zabalza et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1998. -V. 1406. - P. 51-61.