Выделение секреторных гранул лимфоцитов

4. Вязкость среды в  связи с этим является нежелательным  фактором.

5. При равновесном ультрацентрифугировании  возможна заметно большая загрузка  препаратом, чем при зонально-скоростном центрифугировании.

6. В области равновесия частицы  расположатся в виде полосы, ширина  которой определится соотношением  двух процессов:

концентрирования за счет седиментации — флотации и тепловой диффузии частиц. Эта ширина будет тем меньше, чем круче градиент плотности среды и чем больше масса частиц — увеличение массы уменьшает склонность к диффузии. [7]

 

Электрофорез

Электрофорез (от электро- и греч. рhoresis – несение,перенесение) –метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к передвижению во внешнем электрическом поле. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, основными из которых являются: напряженность электрического поля, величина электрического заряда, скорость и размер частицы, вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза [8].

Физический принцип метода заключается  в следующем: биологические макромолекулы  несут определённый электрический  заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической  диссоциации и концентрации протонов в среде (рН). Под действием электрического поля, в зависимости от знака суммарного заряда положительно заряженные макромолекулы перемещаются к катоду (отрицательно заряженному электроду), а отрицательно заряженные - к аноду (положительному электроду), причём трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. Такое явление носит название электрофореза. Электрическое поле создают в токопроводящих растворах с помощью электродов. [2]

Факторами, обусловливающими подвижность биополимеров в геле, являются: суммарный заряд, масса, форма, линейные размеры макромолекулы и пор геля.

Основой электрофоретического разделения является разная скорость движения заряженных молекул в электрическом поле. Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одинаковой скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине дорожки.

С другой стороны, разделяемые молекулы движутся в геле. Природа любого геля - ситоподобная структура, в которой молекулы воды удерживаются внутри трехмерной сетки, образованной длинными полимерными молекулами. Используемые гели содержат много жидкости (80-99.5%), в которой (т.е. в рабочем буфере) мигрируют макромолекулы. Фракционируемые макромолекулы любых размеров сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду и снижает скорость движения молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие (в агарозном, крахмальном и полиакри-ламидном гелях).

Электрофорез ДНК. В основе разделения нуклеиновых кислот электрофорезом в агарозном геле лежит принцип молекулярного сита, так как нуклеиновые кислоты имеют отрицательный суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией остатков фосфорной кислоты. Величина заряда мало зависит от рН окружающей среды и для всех нуклеиновых кислот отношение заряда к массе практически одинаково, поэтому фракционирование их при электрофорезе идёт за счёт различия размеров и формы молекул. Скорость миграции и эффективность разделения различных образцов нуклеиновых кислот в агарозном геле определяется размером молекул и их конформацией, концентрацией агарозы, напряжённостью электрического поля [8].

ДНК: молекулярная масса измеряется в парах азотистых оснований  (base-pairs, англ.), сокращенно - bp, соответственно - килоbp (1000 bр) или кbр.

Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью из-за различий в силе трения и электростатического взаимодействия с окружающей средой.

Буфер создает и стабилизирует  рН носителя и, тем самым, влияет на скорость миграции разделяемых веществ. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. Оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков исходной смеси.

Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с учетом обеспечения  теплоотвода, как для белков, но и с таким расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 5 В/см геля. При больших значениях напряженности поля крупные молекулы нуклеиновых кислот могут, деформируясь, «протискиваться» через поры геля независимо от своей массы. Видно, что проведение электрофореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля и область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается.

Особенности электрофореза белков. Белки – это цвиттер-ионы, т.е. молекулы, имеющие и положительно (+) заряженные и отрицательно (-) заряженные радикалы. Поэтому молекула белка в растворе при любом рН, отличным от изоэлектрической точки, имеет определенный преобладающий заряд (+) или (-) и мигрирует к соответствующему полюсу в постоянном электрическом поле. Позднее был разработан метод ступенчатого электрофореза (диск- электрофорез (от англ. «discontinuous» - прерывистый). Отличительная особенность диск-электрофореза - это полимеризация на пластине двух гелей: рабочего (мелкопористого) и над ним – «формирующего» (крупнопористого) геля. Диск-электрофорез – метод, сочетающий в себе разделение белков по их общему электрическому заряду, по величине молекулярной массы и по форме. Использование двухслойного носителя с различным размером пор и двух буферов, отличающихся между собой по составу и рН, обеспечивает концентрирование исследуемых белков в узкой стартовой зоне. Это важно для чёткого разделения смеси белков.

Раствор, в котором  мигрируют белки, удерживается сеткой полиакриламидного геля (ПААГ). ПААГ служит при электрофорезе поддерживающей средой и принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря эффекту молекулярного сита.

В качестве носителя при  диск-электрофорезе используют ПААГ, который имеет структуру трехмерной сетки. Получают его сополимеризацией акриламида и сшивающего агента N,N¢- метиленбисакриламида. Подбирая соответствующую концентрацию акриламида получают гель с нужным размером пор. При работе с глобулярными белками пользуются соотношением между средней молекулярной массой белков (М) и концентрацией (С) акриламида, которую надо взять для полимеризации, например (см. табл. 2):

Таблица 2. Выбор концентрации акриламида в зависимости от мол. массы белка

М	С, %
10000 – 30000	15,0 – 30,0
30000 – 100000	7,5 – 15,0

 

В качестве катализаторов  при получении ПААГ - геля используют персульфат аммония и N,N,N¢,N¢-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД). Варьируя концентрацией полимера можно получить гели с широким диапазоном пор.

Для удобства изложения используются следующие обозначения: Т - процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, С – процентное отношение массы метиленбисакриламида (Бис) к общей массе обоих мономеров.

На практике для исследования белков часто Т составляет 30 %, а С-2,6 %. Чтобы приготовить растворы используют следующий расчет:

Количество Бис → Т ´ С / 100 = 30´2,6/100=0,76г. Количество акриламида → 30 г -  0,76 г =29,24 г.

Навески акриламида и  бис-акриламида растворяют в 100 мл дН₂О.

Характеристика  миграции белков. Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле (Rf′) пропорциональна их подвижности в свободной жидкости (Rf_O), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к её массе. Фактором, обуславливающим отличие Rf′ от Rf_O, является сила трения о гель. Сила трения зависит от соотношения линейных размеров белков и пор геля, и, следовательно, от молекулярных масс белков. Молекулярные массы большинства белков не превышают 500000, поэтому использование гелей агарозы не целесообразно. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем от 5% до 20 % акриламида.

Как говорилось выше, белки  являются цвиттер-ионами. Их суммарным зарядом, а, следовательно, и отношением заряда к массе можно управлять изменением рН буфера, в котором полимеризуется ПААГ и ведется электрофорез. Оптимальное значение рН рабочего буфера обуславливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих смесь. Таким образом, рН рабочего буфера не должно слишком отличаться от изоэлектрических точек всех белков смеси (при изоэлектрической точке все белки имеют нейтральный заряд). Для кислых белков оптимальные значения рН – нейтральное или слабощелочное. Белки мигрируют от катода (-) к аноду (+). Для щелочных белков (гистонов, белков рибосом и т.д.) целесообразно использовать слабокислые буферы (рН = 4 – 5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода (+) к катоду (-). Обычно скорость миграции зависит от трех параметров анализируемых белков: величины молекул, формы молекул и суммарного заряда.

Для однозначного определения  молекулярной массы белка по скорости его миграции при электрофорезе  полипептидную цепочку распрямляют (рис.1). Такой приём используется при электрофорезе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (ДСН - C₁₂H₂₅OSO₃Na).

 

Рис. 1. Схема денатурации  белка

Разделение белков по размеру с использованием додецилсульфата  натрия (ДСН). Суть метода. Электрофорез в ПААГ-ДСН позволяет фракционировать белки только по молекулярной массе. Для этого белки обрабатывают трёхкратным избытком ДСН-Na (1,4 мг ДСН-Na на 1 мг белка). Под действием ДСН олигомерные белки диссоциируют на субъединицы и денатурируют. Постоянство соотношения детергент/белок делает постоянным отношение (-) заряда к массе любого белка. Благодаря электрическому отталкиванию остатков серной кислоты на поверхности белка полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жёсткого эллипсоида вращения (рис.2).

 

Рис.2. Схематичное изображение полипептидной цепочки после добавления ДСН

Размер малой оси  эллипсоида равен 1,6 нм, большой - линейно связан с числом аминокислотных остатков, т.е. с молекулярной массой. Электрофоретическая подвижность (Rf′) связана с молекулярной массой белка (М) соотношением: Rf′ = A – B lg M, где А и В – коэффициенты пористости геля и др. условий.

Величину электрофоретической  подвижности (Rf) определяют в относительных единицах, выражающих отношение пути миграции белка к миграции бромфенолового синего за время электрофореза. Одновременно проводят электрофорез белков-«маркёров», молекулярные массы которых известны. [9]

Заключение по обзору литературы

Итак, многолетние исследования показывают, что ДНКазы представляют собой лабильную  систему, чутко реагирующую на различные прямые и опосредованные воздействия.

ДНКазы важны не только в процессах нуклеинового обмена, но и для поддержания физиологической концентрации ДНК в организме человека. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки анти-ДНК антител и развитию различного рода патологий. Развитие аутоиммунных заболеваний также связывают с изменением активности нуклеаз иммунокомпетентных клеток.

Идентификация новых  нуклеаз, в том числе апоптотических, должна проложить путь для дальнейших исследований по раскрытию новых функций нуклеаз и осветить скрытые связи между апоптотической деградацией ДНК и заболеваниями человека. [10]

Таким образом, объяснимо наше внимание к изучению свойств нуклеаз лимфоцитов, выделенных из периферической крови больных бронхиальной астмой.

 

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

В связи с изучением  литературы по данному вопросу целью работы явилось освоение метода выделения секреторных гранул Т-лимфоцитов и характеристика их белкового состава методом электрофореза.

В соответствии с целью  были поставлены следующие задачи:

1. Освоить метод ультрацентрифугирования и работу на ультрацентрифуге Beckman Coulter Optima^TM L-series.
2. Выделить фракцию Т-лимфоцитов низкоскоростным центрифугированием в градиенте плотности фиколла.
3. Выделить секреторные гранулы Т-лимфоцитов методом ультрацентрифугирования.
4. Определить в секреторных гранулах наличие белковых фракций методом электрофореза.

 

 

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект  исследования. Объектом изучения служили лимфоциты, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Забор крови (5 мл) осуществлялся путем венопункции кубитальной вены. Кровь забирали в пробирки, содержащие антикоагулянт Na₂-гепарин. Забор крови проводился в поликлинике инфекционно-аллергических заболеваний, Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии.

Выделение Т-лимфоцитов. Собранные образцы крови разводили физиологическим раствором: 2 мл ФСБ + 3 мл крови. Осторожно перемешивали и медленно наслаивали разведенную кровь на 5 мл градиента плотности фиколла-400 (r=1.077 г/см). Центрифугировали в течение 40 минут при 3000 об/мин при комнатной температуре (Eppendorf 5810 R). При разделении лимфоциты образуют плавающее кольцо на поверхности фиколла. Дозатором отбирали кольцо лимфоцитов и переносили в чистые пробирки. Лимфоциты отмывали 5 мл физиологического раствора: центрифугировали 10 минут при 2000 об/мин (Eppendorf 5810R). Супернатант сливали, осадок суспенизировали раствором фосфатно-солевого буфера (5 мл) и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин (Eppendorf 5810 R).

Получение экстракта  гранул из цитоплазмы лимфоцитов. лимфоциты промывали в 1 мл 0.32 М сахарозы в 0,01 М трис-буфере, рН 7,3 и 1 мл 0.003 М CaCl₂ в 0.01 М трис-буфере, рН 7,3. Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге К-24. К полученному осадку добавляли 1 мл 0.01 М трис-буфера рН 7,3 и разрушали клетки в стеклянном гомогенизаторе Поттера 2 мин (в “ледяной бане”), добавляли 3 мл 0.01 М трис-буфера и оставляли на 30 мин в “ледяной бане”. Центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин, 4°С (Eppendorf 5810R), отбирали супернантант. Осадок промывали в 1 мл 0.01 М трис-буфере и центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин (Eppendorf 5810R). Собирали супернатант. Процедуру повторяли еще один раз. супернатанты объединяли, таким образом, был получен “постядерный” супернатант. Готовили раствор фиколла (r=1.080 г/см). Полученный раствор центрифугировали при 19500 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Beckman (с ротором SW55). Поверх полученного градиента перколла наслаивали 2.5 мл “постядерного” супернатанта и центрифугировали при 19500 об/мин в течение 35 мин. Для удаления фиколла, центрифугировали при 45000 об/мин в течение 2,5 часов при 4°С, при этом образовывался плотный осадок фиколла.