Выделение секреторных гранул лимфоцитов

Министерство  образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

 

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ  МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

 

КАФЕДРА БИОХИМИИ

Специальность: 020208 – Биохимия

Специализация: 012307 - Молекулярная биология

 

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

ВЫДЕЛЕНИЕ СЕКРЕТОРНЫХ  ГРАНУЛ ИЗ ЛИМФОЦИТОВ

 

 

 

 

Студент III курса

Группа 100

«       » ____________  2013 г. _________________  А.Е. Яхин

 

 

Научный руководитель

д.б.н., профессор кафедры  биохимии

«       » ____________  2013 г. _________________ З.И. Абрамова

 

 

 

Казань-2013

 

СОДЕРЖАНИЕ

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Недавние сообщения [1,2] подчеркивают роль апоптоза, аутоиммунитета и Т-лимфоцитов, как потенциально важных факторов в патогенезе хронических обструктивных заболеваниях легких и, в частности, Т-опосредованного иммунного ответа при астме.

Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют  почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях [3]. Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.

Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.

 

 

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лимфоциты

Лимфоциты - клетки иммунной системы, представляющие собой разновидность лейкоцитов группы агранулоцитов, белых кровяных клеток. Лимфоциты - главные клетки иммунной системы, обеспечивают гуморальный иммунитет (выработка антител), клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулируют деятельность клеток других типов. В крови взрослого человека в норме содержится 20-35 % лимфоцитов (1000-3000 кл/мкл). В то же время кровь содержит только около 2 % лимфоцитов, находящихся в организме, остальные 98% находятся в тканях. Лимфоциты обладают уникальным свойством - способностью распознавать антигены. Лимфоциты образуются в лимфатических узлах, миндалинах, червеобразном отростке, селезенке, вилочковой железе (тимусе) и костном мозге. Большинство покоящихся лимфоцитов представляют собой малые лимфоциты - небольшие клетки с темным ядром, что обусловлено конденсацией хроматина и сравнительно небольшим количеством цитоплазмы, содержащей разрозненные митохондрии. По морфологическим признакам выделяют два типов лимфоцитов: большие гранулярные лимфоциты (чаще всего ими являются NK-клетки или, значительно реже, это активно делящиеся клетки лимфоидного ряда - лимфобласты и иммунобласты) и малые лимфоциты (T и B клетки)[4].

По функциональным признакам различают три типа лимфоцитов: B-клетки, T-клетки, NK-клетки.

• В-лимфоциты распознают чужеродные структуры (антигены) вырабатывая при этом специфические антитела (белковые молекулы, направленные против чужеродных структур).
• Т-лимфоциты выполняют функцию регуляции иммунитета. Т-помощники стимулируют выработку антител, а Т-супрессоры тормозят ее.
• NK-лимфоциты осуществляют контроль над качеством клеток организма. При этом NK-лимфоциты способны разрушать клетки, которые по своим свойствам отличаются от нормальных клеток, например, раковые клетки. Содержание Т-лимфоцитов в крови составляет 65-80 % от общего количества лимфоцитов, В-лимфоцитов - 8-20 %, NK-лимфоцитов - 5-20 %. В образовании антител центральная роль принадлежит B-лимфоцитам. При этом B-лимфоциты обеспечивают специфический приобретенный иммунитет совместно с другими малыми лимфоцитами - T-лимфоцитами, используя разнообразные механизмы, направленные в большинстве случаев на расширение пределов эффективности врожденного иммунитета.

Лимфоциты класса T образуются в зобной железе, или  тимусе, откуда они и получили свое обозначение - "T": предшественники T-лимфоцитов поступают в тимус, где и происходит их созревание. T-лимфоциты подразделяются на ряд подклассов. Главные из них это две различные, неперекрывающиеся субпопуляции: клетки одной из них несут маркер CD4 и в основном "помогают" в осуществлении иммунного ответа или индуцируют его (T-хелперы), клетки другой несут маркер CD8 и обладают преимущественно цитотоксической активностью (цитотоксические T-лимфоциты (T-киллеры).

 

 

2. Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА

Изучение нуклеазного  состава гранул лимфоцитов связано с ролью этих нуклеаз в развитии заболеваний, характеризующихся нарушениями в иммунном ответе. Иммунная система атакует аутологические ткани, приводя к глубоким изменениям. В этом случае ткани инфильтрируются Т-лимфоцитами, некоторых из них с цитотоксической активностью (цитотоксические Т-лимфоциты; ЦТЛ), что приводит к Т-опосредованному аутоиммунному заболеванию.

Лимфоцит-опосредованный цитолиз связывают с работой  специфической нуклеазной активностью цитотоксических клеток [7]. Это кислая ДНКаза с молекулярной массой 66 кДа активируется ионами Ca²⁺ и ингибируется Zn²⁺, специфична к днДНК. У больных рассеянным склерозом данная нуклеазная активность повышается и становится чувствительной к оксиду азота, но теряет чувствительность ионам цинка.

некоторые моменты при развитии астмы и орган-специфических аутоиммунных заболеваний (например, инфильтрация лимфоцитов в очаге заболевания) подвели нас к поиску и изучению нуклеазной активности секреторных гранул лимфоцитов крови пациентов с АБА.

 

3. Методы выделения и изучения лимфоцитов

Градиенты плотности  для выделения лимфоцитов из цельной  периферической крови человека.

Фиколл 400 представляет собой гидрофильный полимер сахарозы, имеющий высокий молекулярный вес. Молекулярный вес Фиколла составляет 400000. Осмотическое давление его растворов ниже, чем растворов сахарозы эквивалентной концентрации, что позволяет использовать изотонические градиенты плотности и сохранять физиологические и морфологические свойства клеток и органелл в процессе центрифугирования. Фиколл 400 широко применяется в каждодневной работе с разделением клеток крови и для разделения клеток и органелл путем осаждения под действием силы тяжести. [5]

Фиколл-пак представляет собой готовый к употреблению стерильный раствор плотностью 1,077 г/мл, используемый для выделения лимфоцитов периферической крови человека путем простой и быстрой процедуры Фиколл–Пак представляет собой смесь Фиколла 400 (5.7 % вес/объем) и диатризоата натрия  (9,0 % вес/объем). Фиколл-Пак используется для выделения лимфоцитов при определении тканевой совместимости и цитотоксичности. Процедура выделении позволяет получать высокий выход жизнеспособных лимфоцитов без нарушения соотношения между Т – и В-клетками.

Перколл – уникальная среда для центрифугирования в градиенте плотности, специально предназначенная для поддержания физиологических условий в процессе центрифугирования. Среда представляет собой стерильный коллоидный раствор частиц двуокиси кремния, покрытых поливинилпирролидоном (ПВП). Перколл нетоксичен для клеток и может образовывать градиенты с плотностью в диапазоне до 1,3 мг/мл. Градиенты можно преформировать, либо они формируются спонтанно при центрифугировании. Перколл имеет низкую осмоляльность (20 мосм/кг H₂O), благодаря чему на протяжении градиента фактически поддерживаются физиологические условия. Вследствие большого размера частиц центрифугирование раствора перколла при умеренных скоростях приводит к формированию градиента плотности. Поэтому разделение обычно происходит очень быстро. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотоничной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Не составляет труда создать пологий градиент, что позволяет проводить весьма эффективное разделение мембранных фракций по их плавучей плотности.

Свойства  перколла:

1. Диапазон плотностей пригоден для равновесного центрифугирования клеток, вирусов и субклеточных частиц с константой десиментации > 70S.
2. Устанавливается на физиологическую ионную силу и pH.
3. Низкая вязкость.
4. Не проникает сквозь биологические мембраны.
5. Может быть стерилизован многократно.
6. Совместим с биологическими материалами.
7. Легко отделить от очищенного материала.
8. Нет существенного эффекта гашения при регистрации радиоактивности. [5]

Ультрацентрифуга

Ультрацентрифуги — наиболее узкоспециализированный тип приборов, служащий главным образом для исследовательских задач, седиментации вирусов, выделении субклеточных структур, белков и других высокомолекулярных соединений, нуклеиновых кислот и, в целом, разделения частиц размером 100 нм и менее. Принцип работы ультрацентрифуги аналогичен остальным лабораторным центрифугам, но по своим техническим параметрам они значительно превосходят все лабораторные модели. Они способны достигать скорости 150 000 об/мин и ускорения свыше 1 000 000g. Кроме угловых и бакетных роторов, центрифуги могут оснащаться проточными  или зональными роторами с одной большой внутренней полостью для разделяемой жидкости. По исполнению ультрацентрифуги могут быть как настольными, так и напольными. Производятся приборы данного класса компаниями Beckman Coulter и Thermo Scientific.

Мы использовали ультрацентрифугу компании Beckman Coulter Optima^TM L-series.

Напольные ультрацентрифуги серии Optima L способны работать на скорости 100 000 об/мин (L-100K) с ускорением до 694000×g/802000×g (табл.1). Центрифуги комплектуются огромным рядом угловых и горизонтальных роторов, снабжены надёжным вакуумированным индукционным приводом, системой управления и контроля на базе микропроцессора и безопасной для окружающей среды системой охлаждения, в которой не используются фторированные углеводороды или другие жидкие хладагенты, встроенной системой коррекции дисбаланса ротора до 10%. Серия Optima L в полной мере соответствует установленным требованиям при работы с биологически опасными материалами, имеются соответствующие сертификаты на биобезопасность на нескольких уровнях. Центрифуги подключаются к сети 220В, что позволяет размещать их в любом удобном месте.[6]

Таблица 1. Технические характеристики ультрацентрифуг серии Optima L

Диапазон скоростей	Optima L-90K: 1 000 — 90 000 об/мин, с шагом 100 об/мин  Optima L-100K: 1 000 — 100 000 об/мин, с шагом 100 об/мин
Контроль скорости	± 20 об/мин
Максимальное ускорение	Optima L-90K: 694000×g Optima L-100K: 802 000 × g
Вместимость	1 500 мл
Объём образца в одной ячейке	от 230 мкл до 250 мл
Режимы работы	По таймеру до 99 часов 59 минут в режим HOLD w2t
Установка температуры	0°...+40°C, с шагом 0.1°С
Контроль температуры	± 0,5°C от установленного значения
Контроль дисбаланса	±5 мл или 10% при объёме менее 5 мл
Температура окружающей среды	+15°...+40°C
Система охлаждения	Используется экологически безопасный хладогент
Профили ускорения	— быстрый: от 0 об/мин до заданной скорости; — медленный: от 0 до 500 об/мин, далее  быстрый разгон до установленной скорости
Профили торможения	— динамическое торможение; — медленное (до 500 об/мин быстрое  торможение, далее медленная  остановка; — без торможения
Программы	9 программ, устанавливаемых пользователем, возможность отложенного старта
Система уменьшения трения	да
Тепловыделение	1 кВт
Уровень шума	менее 57 дБ
Внешние габариты	В: 1207 × Г: 673 × Ш: 940 мм
Вес	465 кг
Требования к электросети	220-240 В, 20 А, 50 Гц (однофазный ток)

 

Зонально-скоростное центрифугирование

От технически грамотного осуществления процесса ультрацентрифугирования зависит успех эксперимента, а также сохранность и срок службы дорогостоящей машины. Поэтому давайте разберемся, что представляет собой метод ультраценрифугирования.

Особенности этого типа центрифугировнаия отражены в названии: «скоростное», потому что частицы разделяются по скорости оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды, и «зональное» так как частицы разных размеров оседают более или менее ограниченными слоями – зонами. Частицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновременно, при одном центрифугировании.

Исходную смесь частиц наносят в виде тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую  весь объем пробирки бакет-ротора. В  ходе центрфугирования наиболее тяжелые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки. За ними с отставанием, но тоже в виде отдельного слоя, двигаются менее крупные частицы, затем еще более мелкие и т.д. Таким образом, образуются дискретные зоны, или полосы частиц, отличающихся друг от друга скоростью оседания.[7]

Равновесное центрифугирование

Идея метода состоит  в создании такого градиента по длине  пробирки (в бакет-роторе), чтобы  плотность среды центрифугирования  у дна была больше, чем у наиболее плотных частиц, а у мениска  — меньше, чем у наименее плотных. При достаточно длительном центрифугировании частицы будут перемещаться вдоль градиента до тех пор, пока не достигнут положения, в котором плотность среды равна их плавучей плотности. Движение прекращается, частицы различной плотности располагаются в разных участках градиента. Таким образом, осуществляется фракционирование частиц по их плотности.

Такое разделение имеет  следующие особенности:

1. Размеры частиц и  их массы не будут сказываться  на окончательном распределении.  Положение на градиенте будет определяться только плотностью частиц.

2. Движение частиц  к положению равновесия будет  происходить как из области  более низкой плотности градиента,  чем их плавучая плотность,  так и из области более высокой  плотности. Таким образом наряду  с седиментацией будет происходить и флотация. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий начальный слой препарата на жидкость, заполняющую пробирку. Можно даже весь препарат смешать с полным объемом градиентной среды.

3. Процесс центрифугирования  должен быть весьма длительным, так как при подходе к положению равновесия частицы будут двигаться очень медленно.