Технологія виробництва вітаміну В12 (ціанкобаламіну)

В якості теплоносія для  сушіння використовують гази бродіння, що спалюються в печі 39. Сухий порошок надходить в бункер 33 і розфасовується в поліетиленові мішки, вкладені в крафт-пакети.

Відсутність промислових  відходів, доступність сировини, безперервність методу, що не вимагає стерильних умов, роблять його економічним.

Кормовий вітамін В₁₂ отримують у Росії на Грозненському ацетонових і Єфремівському біохімічному заводах. Для виробництва вітаміну В₁₂ передбачені і за останній час впроваджені системи автоматизації основних стадій технологічного процесу.

Сухий концентрат КМБ-12, крім вітаміну В₁₂ (100 мг/кг препарату), містить ряд інших рістстимулюючих речовин. Особливо гарні результати в тваринництві отримують при поєднанні вітаміну В₁₂ з малими дозами антибіотиків, зокрема з біоміцином. Реалізація в нашій країні описаного способу і одержання концентрату вітаміну В₁₂ дозволили повністю забезпечити тваринництво цим вітаміном.

У США майже всі вироблювані  комбікорми для свиней і птахів збагачують вітаміном В₁₂. Показано, що білок тваринного походження можна замінити рослинним білком за умови збагачення кормосумішей вітаміном В₁₂ в дозі 60 мкг/кг.

Українським науково-дослідним  інститутом спиртової та лікеро-горілчаної промисловості розроблена технологія одержання кормового концентрату вітаміну В₁₂ шляхом зброджування мелясного-спиртової барди змішаної культурою метаноутворюючих бактерій. Попередньо на мелясно-спиртовій барді вирощують кормові дріжджі. Після сепарування дріжджів отримують культуральну рідину, що містить 7-8% сухих речовин. На цій рідині вирощують метаноутворюючі бактерії і отримують з 1 м³ вихідної барди 1,5-2 г вітаміну В₁₂.

Культуральну рідину упарюють до вмісту 60-70% сухих речовин, змішують з наповнювачем і висушують. В якості наповнювача використовують кукурудзяне борошно, висівки і т. п. Сухий концентрат розмелюють і розфасовують у мішки. В 1 кг кормового концентрату міститься: вітаміну В₁₂ – 18 - 20 мг, В₂ – 41 мг, РР 146 мг і інші вітаміни. Термін зберігання 12 місяців.

Випробування препарату  багатьма науково-дослідними установами та господарствами показали ефективність його застосування в свинарстві та птахівництві.

В останні роки в Японії продемонстрована можливість отримання  вітаміну В₁₂ з використанням іммобілізованих клітин пропіоновокислих бактерій, які в результаті мутацій виділяють вітамін в середовище. Розробляються принципово нові методи біосинтезу вітаміну В₁₂ шляхом трансформації хімічно близьких йому з'єднань, наприклад уропорфірину III клітинами пропіоновокислих бактерій і артробактера, а також отримання нових аналогів вітаміну В₁₂ [3]. 

2.5.Виробництво  вітаміну В₁₂ штамом бактерій Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д

Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості і стосується нового штаму, яка продукує вітамін В₁₂. Штам бактерій Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д – продуцент вітаміну В₁₂ росте при 28-32° С і рН 7-7,2 і постійному перемішуванні. Ріст культури відбувається паралельно з біосинтезом вітаміну В₁₂ в аеробних умовах. Продуктивність культури за 150 годин росту ферментації становить 130-150 мкг/мл (табл. 1), (діагр. 1).

Таблиця 1. Продуктивність культури Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д

Штам бактерій Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д продукує вітамін В₁₂, який застосовується як антианемічний препарат в медицині та у виробництві кормових добавок для сільськогосподарських тварин та птиці.

Діаграма 1. Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д

В даний час промисловість  використовує для отримання вітаміну В₁₂ тільки мікробіологічний синтез.

Відомі способи отримання  мікробіологічними способом вітаміну B₁₂ за допомогою метаноутворюючих бактерій (Methanobacteria) (патент США 3961971 (1976 р.)), пропіоновокислих бактерій (патент США 4210720 (1980 р.), що належить японській фірмі Nippon Oil Company; в Японії – фірмі Дайсеру Кагаку Коге (ЕР 647717, 1994 рік) виробництво вітаміну здійснює за допомогою бактерій Acenetobacterium, фірма Takeda Chemical Industries LTD (патент США 5545538) отримує вітамін В₁₂ з використанням бактерій Rhizobium сolalaminogenum FERMBP-4429, фірма Ніппон Секію к.к. (патент Японії 5-6996) в якості продуцента вітаміну В₁₂ застосовує штам бактерій Propionibacterium shermani або frendenreichii, стійких до пропіонової кислоти. При даних способах отримання вітаміну В₁₂ концентрація вітаміну B₁₂ в культуральній рідини не перевищує 60-70 мкг/мл.

У Росії мікробіологічний синтез вітаміну В₁₂ за допомогою бактерій Propionibacyerium shermaniі (патент 1737915) дозволяє досягати концентрації вітаміну В₁₂ в культуральній рідині на рівні 40-50 мг/л (прототип) [5].

Суть: штам бактерій Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д - продуцент вітаміну В₁₂ отриманий шляхом багатоступінчастої селекції і відбору активних по біосинтезу вітаміну B₁₂ варіантів з колекційного штаму Pseudomonas fluorescens B98.

Штам депонований у  колекції мікроорганізмів Інституту  біохімії і фізіології мікроорганізмів РАН під номером BKM В-2224Д.

При вирощуванні продуцента на ферментаційному середовищі з мелясою, неорганічними солями і стимуляторами вітаміноутворення концентрація вітаміну В₁₂ в культуральній рідині досягає величини 120-150 мкг/мл.

Штам Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д (рис. 8) характеризується наступними ознаками (культурально-морфологічні ознаки):

Рис. 8. Pseudomonas fluorescens

• бактерії є грамнегативними рухомими паличками розміром 0,45-0,85, 0,6-15 мкм, неспороутворюючі. На агаризованому середовищі утворює округлі колонії 1-2 мм білого кольору. Клітини знаходяться в основному в скупченнях (рис. 9);
• штам стійкий при пересіву на щільних середовищах;
• ріст культури на рідких поживних середовищах відбувається паралельно з біосинтезом вітаміну В₁₂;
• температурний оптимум росту 30° С, рН 7-7,2;
• на твердому живильному середовищі з мелясою утворюють біло-сірі блискучі колонії, до кінця 7 діб виражений центр, розмір колоній 2-3 мм;
• факультативний аероб.

Концентрація вітаміну B₁₂ визначається методом дифузії в агар з використанням культури Е. соli 113-3 і спектрофотометричним – принцип якого полягає в трансформації коферменту B₁₂ в кобаламіннітрит. Концентрація кобаламіну визначається на спектрофотометрі при довжині хвилі 361 нм.

Рис. 9. Pseudomonas fluorescens

2.5.1. Поживне середовище  для підтримання штаму Pseudomonas fluorescens

Для підтримки штаму використовують агаризоване середовище з мелясою наступного складу, г / л:

• меляса – 100,0;
• амоній фосфорнокислий двозаміщений – 1,5;
• сірчанокислий амоній – 0,3;
• агар мікробіологічний – 20,0;
• вода – до 1 л;
• рН - 7,0-7,2.

Фізіолого-біохімічні ознаки: не гідролізує желатин, крохмаль, гідролізує лецитин. В якості джерела вуглецю засвоює сахарозу, бетаїн, не засвоює глюкозу, асимілює глутамінову, пропіонову кислоти. Ріст при 42° С варіює. Денітрифікація варіює [2].

 

 

2.5.2. Зберігання  культури

Зберігають штам у вигляді ліофільно-висушеної культури при температурі 4° С протягом 2-3 років або на щільних середовищах при постійному пересіву.

Умови біосинтезу вітаміну В₁₂ штамом Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д

Біосинтез вітаміну В₁₂ культурою Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д здійснюється за наступною схемою: посівна культура на агаризованому середовищі → посівна культура на колбах на рідкому середовищі → культура на рідкому середовищі в посівному апараті → біосинтез на рідкому середовищі в ферментері.

2.5.3.Поживне середовище  для отримання посівного матеріалу Pseudomonas fluorescens

З метою отримання посівного матеріалу для засівання посівних апаратів використовують середовище наступного складу:

• меляса – 6-12%;
• двохосновний фосфат амонію – 0,01-0,1%;
• кобальт хлористий – 0,001-0,003%;
• магній сірчанокислий – 0,1-0,3%;
• марганець сірчанокислий – 0,01-0,05%;
• цинк сірчанокислий – 0,002-0,02%;
• 5-6-диметилбензілімідазол – 0,001-0,003%;
• вода – до 1000 л;
• рН середовища – 7,0 ± 0,2.

У качалочну колбу об'ємом 750 мл з об'ємом середовища 50 мл вносять культуру з пробірки в кількості 0,1%.

Вирощують культуру при температурі 30° С протягом 48 годин.

Отриманою культурою в дозі не менше 0,1% засівають стерильне поживне середовище в посівному апараті наступного складу:

• меляса – 6-12%;
• двохосновний фосфат амонію – 0,01-0,1%;
• кобальт хлористий – 0,001-0,003%;
• магній сірчанокислий – 0,1-0,3%;
• марганець сірчанокислий – 0,01-0,05%;
• цинк сірчанокислий – 0,002-0,02%;
• 5-6-диметилбензілімідазол – 0,001-0,003%;
• вода – до 100 л;
• рН середовища – 7,0 ± 0,2.

Умови ферментації: постійне перемішування, температура 28-32° С, при подачі повітря 0,2-0,5 л/л поживного середовища за 1 хв протягом 40-60 годин до оптичної щільності більше 0,2.

2.5.4. Поживне середовище  для основного процесу ферментації

Отриманим посівним матеріалом в потрібній дозі засівають стерильне ферментаційне середовище наступного складу:

• меляса – 14-20%;
• сахароза – 2,0-5,0%;
• гліцерофосфатна кислота – 0,2-0,4%;
• кобальт хлористий – 0,01-0,03%;
• холінхлорид – 1,0-2,0%;
• магній сірчанокислий – 0,1-0,3%;
• оксид магнію – 0,05-0,07%;
• сірчанокислий амоній – 0,2-0,4%;
• цинк сірчанокислий – 0,05-0,1%;
• оксихлористий кобальт – 0,01-0,02%;
• 5-6-диметилбензілімідазол – 0,01-0,02%;
• гліцерин – 0,1-0,2%;
• вода водопровідна – до 100 л;
• рН середовища – 7,0 ± 0,2.

Ферментацію проводять при  температурі культуральної рідини 28-32° С, при постійному перемішуванні, надлишковому тиску 0,5 атм, при витраті повітря 0,2 л/л середовища за 1 хв.

Культура Pseudomonas fluorescens BKM В-2224Д характеризується тим, що її ріст відбувається паралельно з біосинтезом вітаміну В₁₂ в аеробних умовах на протязі всього процесу ферментації.

Вміст вітаміну В₁₂ в культуральній рідині до кінця ферментації становить 120-150 мкг/мл при визначенні мікробіологічним методом з використанням в якості тест-культури Е. соli 113-3 або спектрофотометричним методом. При культивуванні пропіоновокислих бактерій вміст вітаміну B₁₂ в культуральній рідині 40-50 мкг/мл [1].

По закінченні процесу  ферментації культуральну рідину підкислюють  сірчаною кислотою до значення рН 5,8. Проводять лізис культури при температурі 90-100° С. Для отримання готового продукту культуральна рідина може бути перероблена на розпилювальній сушарці з наповнювачами (крейда, сіль, висівки та ін.) або відправлена ​​на стадії отримання і виділення вітаміну B₁₂ в чистому вигляді.

Результати перевірки  рівня біосинтезу вітаміну B₁₂ культурою Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д в лабораторних умовах наведені далі (табл. 2).

 

 

Таблиця 2. Рівень біосинтезу вітаміну B₁₂ культурою Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д

Результати перевірки  рівня біосинтезу вітаміну B₁₂ культурою Pseudomonas fluorescens ВКМ У-2224Д в дослідно-промислових умовах (в апаратах об'ємом 2,5 м³) наведені в таблиці 2.

2.6. Застосування вітаміну В₁₂

Для збагачення кисломолочних  продуктів вітаміном B₁₂ використовують пропіоновокислі бактерії як у чистому вигляді, так і в вигляді концентрату, приготованого на молочній сироватці. Для потреб тваринництва вітамін B₁₂ отримують, використовуючи змішану культуру, що містить термофільні метаноутворюючі бактерії [1,4]. Встановлено утворення кориноїдів не тільки в змішаній, але і в чистій культурі метанутворюючих бактерій Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum, Mb. thermoautotrophicum при зростанні в присутності H₂ і CO₂. Вміст кориноїдів у метанутворюючих бактерій становить 1,0-6,5 мг/г сухої біомаси. За допомогою змішаної культури метанутворюючих бактерій розроблено метод отримання кормового препарату вітаміну B₁₂-KMБ12. Субстратом для метанового бродіння служить ацетонобутилова і спиртова барда. Ацетонобутилову барду отримують в результаті видалення розчинників з культуральної рідини Clostridium acetobutylicum, які зброджують патокової-борошняні закупорення. Для метанового бродіння використовують декантат барди, що містить 2,0-2,5% сухих речовин. До декантованої барди додають 4 г/м³ СоСl₂ і 0,5% метанолу як стимулятора синтезу кобаламіну. В якості біостимуляторів вносять також карбамід і диамонійфосфат, 5,6-ДМБ не вносять, оскільки CN=B₁₂ і фактор III, що володіють біологічною активністю, становлять до 80% від суми всіх кориноїдів. Вихідна барда має температуру близько 100° С і практично стерильна. Перед надходженням у ферментери барда охолоджується до 55-57° С. В якості вихідної культури використовують змішану культуру метаноутворюючих бактерій, що здійснюють термофільне «метанове бродіння» стічних вод. Отримання концентрату вітаміну B₁₂ включає наступні технологічні стадії: безперервне зброджування барди комплексом бактерій, згущення метанової бражки і сушку згущеної маси на розпилювальній сушарці [1,4]. Бродіння проводять в залізобетонних ферментерах безперервним способом протягом року. Важлива умова нормального процесу бродіння - контроль рівня жирних кислот і амонійного азоту. Вітамін B₁₂ нестійкий при тепловій обробці, особливо в лужному середовищі. Тому перед випарюванням до метанової бразі додають Cl^- до оптимального значення рН 5,0-5,3 і сульфіт Na (оптимальний вміст 0,07-0,1%). Перед подачею на установку випарювання метанова бражка дегазується шляхом нагрівання до 90-95° С при атмосферному тиску. Бражку згущують до 20% сухих речовин в чотирьохкорпусних випарних апаратах. Згущена метанова бражка висушується на розпилювальній сушарці [7].