Технологія виробництва вітаміну В12 (ціанкобаламіну)

Відомі активні продуценти вітаміну В₁₂ у псевдомонад, серед яких краще за інших вивчений штам Pseudomonas denitrificans. МВ-2436 – мутант, який дає на оптимізованому середовищі до 59 мг/л кориноїдів. Штам застосовують для промислового отримання вітаміну В₁₂ на фірмі Мерк в США. Інтерес представляють термофільні бацили, а саме Bacillus circulans і Bac. stearothermophilus, які ростуть відповідно при 60 і 75 ° С і за 18 годин культивування без дотримання стерильних умов дають високі (2,0-6,0 мг/л) виходи вітаміну. Кориноїди синтезують Rhodopseudomonas palustris, фототрофні пурпурні бактерії Rhodobacter sphericus, Rh. capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum і ряд інших видів. Поряд з вітаміном В₁₂ вони утворюють безкобальтові кориноїди, роль яких для продуцентів не встановлена. Значні кількості вітаміну В₁₂ утворює ціанобактерія Anabaena cylindrica, одноклітинні зелені водорості Chlorella pyrenoidosae і червоні водорості Rhodosorus marinus [3].

Продуценти вітаміну В₁₂ культивують в середовищах, приготованих на основі харчової сировини: соєвого борошна, рибного борошна, м'ясного та кукурудзяного екстракту. В останні роки виявлені мікроорганізми, що утворюють кориноїди високої якості при утилізації нехарчової сировини. Achromobacter sp., використовуючи ізопропіловий спирт як джерело вуглецю та енергії, накопичує до 1,1 мг/л провітаміну, Pseudomonas sp. синтезує вітамін В₁₂ в середовищі з метанолом або пропандіолом (до 160 мкг/л), факультативний метилотроф (FМ = 02Т) утворює в середовищі з метанолом до 2,6 мг/л вітаміну. Виділено штам Klebsiella 101, утворюючий велику кількість кориноїдів в клітинах тільки при рості на середовищі з метанолом як єдиному джерелі вуглецю і енергії. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.Біосинтез вітаміну В₁₂ ( продуцент Propionibacterium shermanii)

Кожна вирізнювана в молекулі вітаміну структура: кориноїдне кільце, нуклеотидне ядро і амінопропаноловий  місток – мають своє походження. Механізм їх виникнення – предмет інтенсивних, але ще незавершених досліджень. Перші етапи біогенезу кориноїдів ті ж, що й перші етапи синтезу інших тетрапірольних з'єднань (рис. 2). Загальним інтермедіатом тетрапіролів є δ-амінолевулінова кислота (δ-АЛК), що утворюється у більшості організмів в результаті конденсації гліцину і сукциніл-КоА. Однак E. limosum і C. tetanomorphum не включають 2- -гліцин в коринове кільце, що варто було б очікувати, якби гліцин був попередником δ-АЛК. Отже, вже на цьому етапі шлях синтезу вітаміну у бактерій може різнитися [5].

Далі утворюється порфобіліноген, що виникає при конденсації двох молекул δ-АЛК, а при конденсації чотирьох молекул порфобіліногену – уропорфіриноген III (УПГ III). Послідовність реакцій між УПГ III і кобіриновою кислотою отримала експериментальне підтвердження лише в останні роки. Показано, що при порушенні процесу амідування клітини Propionibacterium shermanii виділяють в середовище сполуки, названі коріфіринами – метильовані відновлені похідні уропорфірину III. До теперішнього часу виділено і охарактеризовано три сполуки: коріфірин-1 (метилкоріфірин), коріфірин-2, або сірогідрохлорин (диметилкоріфірин), і коріфірин-3 або, ізобактеріохлорин (три-метилкоріфірин). Мічена δ-АЛК і метіонін включаються в коріфірини, а останні – в вітамін В₁₂.

Метилювання УПГ III з одночасним декарбоксилюванням бокового ланцюжка оцтової кислоти при С₁₂ кільця С призводить до розбіжності шляхів біогенезу вітаміну В₁₂ і інших тетрапіролів. В результаті подальшого метилювання та утворення С - С зв'язку між кільцями А і Д синтезується кобіринова кислота.

Донором семи метильних груп, що включаються в УПГ III, є S-аденозилметіонін. Характер включення атома Со і утворення безпосереднього зв'язку між кільцями А і Д невідомий. На наступному етапі біосинтетичного шляху кобіринова кислота перетворюється в кобінамід (фактор В), при цьому залишки карбонових кислот кобіринової кислоти (рис. 3) амідуються, а до залишку пропіонової кислоти кільця Д приєднується амінопропанол. На цій же стадії відбувається приєднання до коринового кільця 5-дезоксиаденозильної групи і кобіринова кислота стає 5-дезоксиаденозилкобінамідом (коферментна форма фактора В). Амінопропанол, мабуть, утворюється при декарбоксилюванні L-треоніну [8].

Далі кобінамід фосфорилюється з утворенням кобінамідфосфату і, реагуючи з гуанозинтрифосфатом (ГТФ), дає кобінамідгуанозиндифосфат. У коферментну форму кобінамідгуанозиндифосфату відбувається включення нуклеотиду та утворення кобаламін-5'-фосфату.

Вітамін В₁₂, як вже зазначалося вище, містить специфічну азотисту основу – 5,6-ДМБ, яка в природі зустрічається тільки в цій сполуці. Безпосереднім попередником 5,6-ДМБ служить рибофлавін. В молекулу вітаміну В₁₂ 5,6-ДМБ включається у вигляді α-рибазол-5'-фосфату.

Рис. 3. Кобіринова кислота

При ферментативному дефосфорилюванні кобаламін-5'-фосфату утвориться кобаламін. Послідовність реакцій при синтезі кобаламіну з кобінаміду виглядає наступним чином:

1) кобінамід + АТФ →  кобінамід-Ф + АДФ;

2) кобінамід-Ф + ГТФ →  ГДФ-кобінамід + ФФ_н;

3) кобінамід-ГДФ + α-рибазол-5'-фосфат  → кобаламін-5'-фосфат + ГМФ;

4) кобаламін-5'-фосфат →  кобаламін + Ф_н.

Рис. 4. Вітамін В₁₂ (кофермент на форма І)

Відомі дві коферментні  форми вітаміну В₁₂: аденозил-кобаламін (коферментна форма I) (рис. 4) і метилкобаламін (коферментна форма II). Більше 80% всіх синтезованих пропіоновокислими бактеріями кориноїдів знаходяться в коферментній формі I, яка, як уже зазначалося, в якості ліганда містить 5-дезоксиаденозил.

Джерелом аденозилу служить  АТФ. Коферментна форма містить  Со-С-зв'язок і є першою кобальторганічною  сполукою, виявленою в живих системах. Метилкобаламін зазвичай міститься  в клітинах в незначних кількостях, але у М. barkeri метил-фактор III, який містить в нуклеотидній частині 5-оксибензімідазол, становить до 80% від суми всіх кориноїдів.

Регуляція біосинтезу вітаміну В₁₂ здійснюється за принципом репресії. Вітамін В₁₂ пригнічує тільки свій власний синтез, не справляючи впливу на утворення інших тетрапіролів і, як вважають, діє на стадії метилування УПГ III. В якості регулятора виступає лише повна нуклеотидвмісна молекула вітаміну. Гем надає координовану репресію синтезу ферментів початкових стадій біогенезу тетрапіролів.

Функціональною формою вітаміну є аденозилкобаламін (α-(5,6-диметілбензімідазолил)-Со-5-дезоксиаденозилкобамід) (рис. 5) і метилкобаламін (α (5,6-диметилбензімідазолил)-Со-метилкобамід) [2].

2.3.Отримання і застосування вітаміну В₁₂

Рис. 5. Ферментативні реакції, каталізовані аденозилкобаламіном

Світова продукція вітаміну В₁₂ становить 9-11 тис. кг в рік, з них 6500 кг використовують на медичні цілі, а іншу частину – для тваринництва. Виробництво вітаміну В₁₂ засновано головним чином на культивуванні пропіоновокис-лих бактерій (в Україні, Великобританії, Угорщині), мезофільних і термофільних меганогенних бактерій (Україна, Угорщина), а також актиноміцетів і споріднених форм (Італія).

У нашій країні в якості продуцента вітаміну В₁₂ використовують Propionibacterium freundenreichii var. shermanii.

Для отримання вітаміну В₁₂ бактерії культивують періодичним методом в анаеробних умовах в середовищі, що містить кукурудзяний екстракт, глюкозу, солі кобальту і сульфат амонію. Утворені в процесі бродіння кислоти нейтралізують розчином лугу, який безперервно надходить у ферментер. Через 72 години у середовище вносять попередник – 5,6-ДМБ. Без штучного введення 5,6-ДМБ бактерії синтезують фактор В і псевдовітамін В₁₂ (азотистою основою служить аденін), що не мають клінічного значення.

Ферментацію закінчують через 72 години. Вітамін В₁₂ зберігається в клітинах бактерій. Тому після закінчення бродіння біомасу сепарують і екстрагують з неї вітамін водою, підкисленою до рН 4,5-5,0 при 85-90° С протягом 60 хв з додаванням в якості стабілізатора 0,25%-ового розчину NaNO₂. При отриманні Ко-В₁₂ стабілізатор не додають.

2.3.1.Очистка вітаміну  В₁₂

Водний розчин вітаміну В₁₂ охолоджують, доводять рН до 6,8-7,0 50%-ним розчином NaОН. До розчину додають Al₂(SO₄)₃·18Н₂О і безводний FeCl₃ для коагуляції білків і фільтрують через фільтр-прес.

Очищення розчину проводять  на іонообмінній смолі СГ-1, з якої кобаламін елюють розчином аміаку. Далі проводять додаткове очищення водного розчину вітаміну органічними розчинниками, упарювання і очистку на колонці з Аl₂О₃. З окису алюмінію кобаламін елюють водним ацетоном. При цьому КО-В₁₂ може бути відділений від CN- і оксикобаламіну.

2.3.2.Відділення  та кристалізація вітаміну В₁₂

До водно-ацетонових розчину  вітаміну додають ацетон і витримують при 3-4° С 24-48 годин. Випадаючі кристали вітаміну відфільтровують, промивають сухим ацетоном і сірчаним ефіром і сушать у вакуум-ексикаторі над Р₂О₅. Для запобігання розкладання КО-В₁₂ всі операції необхідно проводити в сильно затемнених приміщеннях або при червоному світлі. Таким чином, можна отримати не тільки суміш CN- і оксикобаламінів, але і коферментну форму, яка володіє високим терапевтичним ефектом.

Для хімічного очищення вітаміну В₁₂ використовується його здатність утворювати аддукти з фенолом і резорцином. При цьому способі відділення вітаміну В₁₂ від супутніх йому факторів спрощується. Промисловий концентрат ціанкобаламіну обробляють водним розчином резорцину (або фенолу), виділяють комплекс вітаміну В₁₂ з резорцином (або фенолом), далі розкладають його і отримують кристалічний препарат.

Промисловість України випускає різні форми лікувальних препаратів кобаламінів: ампули зі стерильним розчином CN-В₁₂, приготованого на 0,9%-вому розчині NаСl, таблетки СN-В₁₂ в суміші з фолієвою кислотою, таблетки (муковіту), що містять CN-В₁₂ і мукопротеїд (внутрішній фактор) [1].

Лікувальні препарати в ампулах: камполон, антианемін і гепавіт - містять водний екстракт печінки великої рогатої худоби.

Перспективні дослідження  по мутагенезу пропіоновокислих бактерій як один із способів підвищення продуктивності штаму, а також перевірки та впровадження у виробничі умови інших продуцентів, що здатні рости на дешевій нехарчовій сировині.

Промислове одержання  в Україні вітаміну В₁₂ за допомогою пропіоновокислих бактерій дозволяє повністю задовольнити потреби медицини в нашій країні.

Для збагачення кисломолочних  продуктів вітаміном В₁₂ використовують пропіоновокислі бактерії як у чистому вигляді, так і у вигляді концентрату, приготованого на молочній сироватці.

2.4.Виробництво  кормового препарату на основі  вітаміну В₁₂ (продуцент Methanosarcina barkeri)

Для потреб тваринництва вітамін  В₁₂ отримують, використовуючи змішану культуру, що містить термофільні метаноутворюючі бактерії. Встановлено утворення кориноїдів не тільки в змішаній, але і в чистій культурі метаноутворюючих бактерій Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum (рис. 6, 7), Mb. thermoautotrophicum при рості в присутності Н₂ і СО₂. Вміст кориноїдів у метаноутворюючих бактерій становить 1,0-6,5 мг/г сухої біомаси.

За допомогою змішаної культури метаноутворюючих бактерій в Україні розроблено метод отримання кормового препарату вітаміну В₁₂-КМБ12.

Субстратом для метанового бродіння служить ацетонобутилова і спиртова барда [5].

Рис. 6. Methanobacterium formicum

Ацетонобутилову барду отримують в результаті видалення розчинників з культуральної рідини Clostridium acetobutylicum, що зброджує патоково-борошняні закупорки. Для метанового бродіння використовують декантат барди, що містить 2,0-2,5% сухих речовин. До декантованої барди додають 4 г/м³ СоСl₂ і 0,5% метанолу як стимулятори синтезу кобаламінів. В якості біостимуляторів вносять також карбамід і диамонійфосфат, 5,6-ДМБ не вносять, оскільки CN=В₁₂ і фактор III, володіючи біологічною активністю, утворюю до 80% від суми всіх кориноїдів.

Рис. 7. Methanobacterium formicum

Вихідна барда має температуру близько 100° С і практично стерильна. Перед надходженням у ферментери барда охолоджується до 55-57° С. В якості вихідної культури використовують змішану культуру метаноутворюючих бактерій, що здійснюють термофільне «метанове бродіння» стічних вод.

2.4.1.Отримання  концентрату вітаміну В₁₂

Отримання концентрату вітаміну В₁₂ включає наступні технологічні стадії: безперервне зброджування барди комплексом бактерій, згущення метанової бражки і сушку згущеної маси на розпилювальній сушарці. Бродіння проводять в залізобетонних ферментерах безперервним способом протягом року.

2.4.2.Точки контролю

Важлива умова нормального  процесу бродіння – контроль рівня жирних кислот і амонійного азоту. Вітамін В₁₂ нестійкий при тепловій обробці, особливо в лужному середовищі. Тому перед випарюванням до метанової бражки додають НС1 до оптимального значення рН 5,0-5,3 і сульфіт Nа (оптимальний вміст 0,07-0,1%).

2.4.3.Технологія  виробництва кормового препарату

Перед потраплянням на установку випарювання метанова бражка дегазується шляхом нагрівання до 90-95° С при атмосферному тиску. Бражку згущують до 20% сухих речовин в чотирьохкорпусних випарних апаратах. Згущена метанова бражка висушується на розпилювальній сушарці.

Технологічна схема представлена ​​в Додатку 1. Ацетонобутилова барда з нижньої частини бражного колони надходить у збірник барди 1 і насосом подається в декантатор 3. Відстій барди збирається в збірнику 4 і використовується на корм худобі. Декантат, охолоджений до температури 55-57° С, метанол і хлористий кобальт надходять в ферментер 12. Зброджену масу з верхньої частини ферментера відбирають і направляють в реактор 19, де здійснюють стабілізацію вітаміну В₁₂ шляхом додавання сульфіту натрію і соляної кислоти, змішаних в змішувачі 18. З стабілізованої бражки видаляють гази в сепараторі газів 22, бражку упарюють в випарній установці 24 і збирають в збірниках 26. Згущена метанова бражка перекачується насосом 27 у збірник метанової бражки 28, а звідти насосом 29 в розпилювальну сушарку 31.