Технологія виробництва Амілоризину П10Х

ВСТУП

 
        Ферменти - це високоактивні сполуки білкової природи, які є специфічними каталізаторами реакцій.

Ферменти мають унікальні  властивості (ефективність і специфічність  дії, не токсичність, здатність працювати  в м'яких умовах, переробляти різне  сировину рослинного і тваринного походження, у тому числі і відходи), у зв'язку з чим їх застосування в промисловості  вигідно з економічної та екологічної  точок зору. Їх використовують у  харчовій, фармакологічній, біохімічній  промисловості і в багатьох областях діяльності людини. За допомогою ферментів отримують ряд харчових продуктів.

Слід розрізняти два поняття: ферменти і ферментні препарати. Ферменти знаходяться практично  у всіх живих об'єктах: рослинах, тварин і мікроорганізмів. Ферментні  препарати можуть являти собою суміш  ферментів або фермент одного виду, мати різну ступінь очищення, можуть бути додані в сировину або  продукт, або використовуватися  закріпленими на носії (іммобілізовані ферменти). Як джерело отримання  ферментних препаратів біотехнологічним способом використовують тканини і  органи рослин, тварин і мікроорганізми.

Виробництво ферментних препаратів є одним з перспективних напрямків  розвитку біотехнології.

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Технологія виробництва Амілоризину П10Х

 

Технологія виробництва Амілоризину П10Х (додаток 5) включає такі основні стадії: підготовка поживного середовища, основній процес культивування, очистка і виділення, фасування і відправлення на склад готової продукції.

Підготовка поживного  середовища складається з таких  етапів: вирощування чистої культури, стерилізація поживного середовища, вирощування культури в інокуляторі. Посівним матеріалом служить поверхнево вирощена до густого спороутворення культура гриба або глибино вирощений міцелій. Підготовка живильного середовища полягає в дозуванні компонентів, їх зволоженні до W = 35 ... 40%, стерилізації гострим паром при 120 °С протягом однієї години, до зволоженні W = 55 ... 58%, охолодженні до 40 °С та внесення посівного матеріалу з розрахунку 7,5 · 10⁸ конідій на 1 кг сухої середовища. Ці операції проводять в спеціальному стерилізаторі. Після внесення посівного матеріалу середу перемішують протягом 40 хв. Засіяна живильне середовище вологістю 58 ... 60% розкладається на перфоровані кювети шаром 30 мм і більше, які розміщуються на стелажах розстильної камери.

Основний процес культивування  являє собою процес ферментації. У процесі ферментації регулюють температуру, вологість середовища і витрата стерильного повітря. Зовнішній тепломасообмін мікроорганізмів при культивуванні твердофазном створюється в режимі конвективного руху стерильного повітря через шар середовища методом об'ємної аерації. Повітря виконує роль теплохолодоагента, змінює концентрацію вуглекислого газу в порах середовища і камері, постачає зростаючу культуру киснем. Витрата повітря збільшується пропорційно швидкості виділення тепла біомасою і становить 1 ... 25 л/год на 1 кг середовища, відносна вологість повітря -             98 ...99%.

У період активного росту  міцелій гриба пронизує весь шари матеріалу, обплітаючи частинки середовища, тому в кінці культивування живильне середовище має вигляд щільного коржа  і називається поверхневою культурою. вона містить 65 ... 78% нерозчинних речовин. Після процесу ферментації отримують  дифузійною витяжкою ферменту. Фермент, що знаходяться у внутрішньоклітинному просторі – називається дифузійною витяжкою, через дифузійний опір клітинної стінки міцелію, але він невеликий  і може легко виділятися з культури продуцента методом водної екстракції, якщо це ферментний препарат з очисткою: «2Х» – концентрований розчин ферментів, звільнений від біомаси або «3Х» – висушений препарат. Оскільки запропонована технологія виробництва амілоризину має очистку «П10Х» - це значить, що дифузійну витяжку осадили органічними розчинниками і солями. Тому виділення і очищення складається з наступних стадій:  сепарування (центрифугування), осадження, повторне сепарування, промивання осаду і знову сепарування або центрифугування. У кінці технологічного процесу отримують Амилоризин П 10Х у вигляді тонкого порошку який фасують в паперові мішки масою по 15—25 кг, які поступают на склад де зберігаються при температурі не вище 25°С і відносній вологості повітря не вище 75%.

 

1. Підготовка поживного середовища

 

Продуцентом амілоризину є плеснові гриби виду Aspergillus oryzae. Вони повинні бути чистими культурами спеціально відібраними штамами, які допущені Міністерством охорони здоров'я України до застосування.

Посівний матеріал може бути трьох видів:

  - культура, що виросла  на твердому поживному середовищі;

  - споровий матеріал;

  - міцеліальна культура, вирощена глибинним способом.

  У три етапи отримують  і посівну культуру. Спочатку  музейну культуру продуцента  пересівають на 1 – 1,5 г зволожених  стерильних пшеничних висівок  в пробірку і вирощують в  термостаті до рясного спороутворення. Другий етап - аналогічно, але в  колбах, третій - у посудинах з  500 г середовища.

У стерильних умовах готують  посівну культуру, але вирощують  гриб в нестерильних умовах в кюветах, що встановлюються в ростильних камерах. Тепло, що виділяється в процесі росту грибів, віддаляється продуванням через ростільну камеру конденсованого повітря.

 Оскільки Амилоризин П10Х вирощують поверхневим способом, тому  поживні мають тверду або рихлу консистенцію. На рідкому субстраті утворюється плівка міцелію, яка продукує не тільки амілолітичні ферменти, а й органічні кислоти, інактивуючі їх, тому користуються  в основному твердими середовищами.

 Основним компонентом  майже всіх середовищ є пшеничні висівки, що містять в достатніх кількостях всі речовини, необхідні для живлення гриба. Іноді ще використовують буряковий жом, пивну дробину, картопляну мезгу. Кращі результати досягаються при вмісті крохмалю у висівках або в іншій живильному середовищі не менше 16%.

Пшеничні висівки повинні  бути зволожені і стерилізовані. Для додання середовищі пухкої структури і її збагачення до пшеничних висівок додаються тирсу або солодові паростки. Пивна дробина бідна живильними речовинами, і активність ферментів в культурах грибів, вирощених на ній, в 4-5 разів нижче, ніж на висівках. Зріла культура грибів внаслідок обволікання часток висівок міцелієм має вигляд щільної войлокоподібної маси.

З метою здешевлення поживного  середовища було запропоновано застосовувати  як основу її біошрот - відхід виробництва ферментів, що представляє собою нерозчинний залишок культури після екстрагування ферментів. При збагаченні крохмалем і ростовими речовинами, що вносяться відповідно з картопляною мезгою і солодовими паростками, виходить повноцінна живильне середовище.

На деяких спиртових заводах  використовують поживне середовище, складу: з 80% картопляної мезги (крахмальністю15-16% і вологістю 70-74%), 17% пшеничних висівок і 3% сухих паростків ячмінного солоду (відходу пивоварного виробництва).

У Чехословаччині застосовують суміш, що складається з 30% картопляної  мезги, 30% подрібнений соняшникового  лушпиння, 30% стрижнів кукурудзяних качанів  та 10% висівок, до якої додають 6% кукурудзяного  екстракту або згущеного клітинного соку картоплі.

Стерилізують середу гострим  паром при помішуванні (температура - 105-140 ^оС, час 60-90 хвили). Після цього середовище засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в ростильних камери. Культивують протягом 36-48 годин.

Ріст ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій  і їх проростання (температура не нижче 28^оС), потім ріст міцелію у вигляді пушку сірувато-білого кольору (необхідно виводити виділяєме тепло) і утворення конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (W=55-70%).

 

2. Основний процес культивування

 

Основний процес культивування  включає процес ферментації до утворення неочищеного ферменту Амілоризину ПХ – це  поверхнева культура чи культуральна рідина, потім екстракцією органічними розчинниками отримують дифузійну витяжки ферменту (додаток1). Потім дифузійна витяжка подається на наступну технологічну стадію: виділення і очищення.

З безперервно діючої ростильной установки конструкції ВНІІФСа отримують підсушену подрібнену грибну культуру. Транспортерами 17, 18, ​​19 і 20 культуру подають в дифузори 25. Під час перерви в роботі дифузії підйомник 18 подає культуру в сушарку 23. Висушена культура збирається в бункері 31, звідки через ваги 32 вона надходить в крафт -мішки. Заповнені мішки зашиваються машиною 33 і направляються в склад готової продукції.

На підприємствах ферментної промисловості використовуються дифузійні  установки періодичної дії. Насичення  розчинника в них здійснюється шляхом послідовного пропускання його через  дифузори, заповнюючи поступово свіжим продуктом у міру його вилуговування. Як розчинник застосовують воду з  температурою 30 °С, відповідну стандарту  на питну воду. Щоб уникнути розвитку інфекції в розчиннику в нього  вводять формалін чи іншій антисептик.

При обороті восьмичленної батареї протягом 2,5-3 год. з грибний культури вилуговується до 97-98% ферментів. Кількість відібраної витяжки для Aspergillus oryzae-150-200, від маси сухого речовини культури, що завантажується в дифузори. Концентрація сухих речовин у витяжці в залежності від величини відбору становить від 12 до 22%.

Залежно від режиму роботи дифузійної батареї, виду переробляємої культури та інших факторів витяжка з дифузорів виходить прозорою або мутною (із вмістом зважених речовин). Вилужений продукт (біошрот) збирається у вигляді пульпи в збірнику 27, звідки насосом він перекачується в цех стерилізації та сушіння.

Дифузійна витяжка збирається в збірнику 29, з якого вона надходить  безпосередньо на подальшу переробку  або на попереднє освітлення. В  останньому випадку в витяжку  дозують зі збірки 34 аміачну воду до рН 8,4-8,6; потім витяжку направляють для відділення зважених речовин в сепаратор ВСС-01. Освітлену витяжку підкисляють оцтовою кислотою до рН=4,7-5,4, задають в неї наповнювач і подають в розпилюють сушарку, з якої отримують комплексний препарат ферментів у вигляді тонкого порошку.

 

 

 

 

 

 

3. Очистка і виділення Амілоризину П10Х

 

У водний розчин ферментів, що надійшов з дифузійної установки  в збірку 2 (додаток 3), дозують аміачну  воду або розчин СаС1₂ для кращого відділення з розчину зважених речовин.

З збірника 2 витяжку насосом  подають у сепаратор ВСМ для  відділення зважених речовин або  в сепаратор BCC-0L Тут разом з  осадом з розчину видаляється  значна кількість бактерій. Осад з  сепаратора видаляють, а освітлений розчин надходить у збірник 5. Для  додаткового освітлення витяжку  пропускають через фільтр 7. Подальша переробка розчину обумовлюється  видом одержуваного продукту.

Для отримання згущеного  сиропу ферментного розчину витяжку  подають у вакуум-випарної апарат 21 і 22. Концентрований розчин упаковують в тару.

При отриманні комплексного препарату ферментів (у вигляді  порошку) дифузійну витяжку після  попереднього упарювання направляють  в розпильну сушарку 28. Для сушіння використовується повітря, підігрітий в паровому калорифері 29. Висушений продукт відсмоктується із сушильної камери повітрям, осідає в циклонах 32 і пневмотранспортом подається в циклон 34; звідси він надходить у збірник 40, а з нього на упаковку в тару.

Для отримання більш чистих концентрованих препаратів ферменти осаджують з розчинів шляхом додавання органічних розчинників :етилового або ізопропілового спирту.

При високих вимогах до препарату витяжку перед осадженням з неї ферментів пропускають  через діализатор для видалення залишкових цукрів та інших баластних органічних і мінеральних домішок. Підготовлену витяжку підкисляють оцтовою кислотою до рН 5,5-6, охолоджують розсолом в теплообміннику 10 до 5 °С, змішують в апараті 11 з етиловим (або ізопропіловим) спиртом, попередньо охолодженим до 2-3 °С. Для кращого відділення осаду в змішувач додають 0,2% хлористого кальцію. Змішувач забезпечений мішалкою.

Спирто-водна суспензія ферментів подається в сверхцентріфуги 12 (або сепаратор) для відділення твердого осаду. Осад ферментів, отриманий з центрифуги, промивають міцним спиртом і направляють у вакуум-сушарку або в сублімаційну сушарку.

Висушена ферментний препарат розмелюють в кульової млині дісмембраторе або в млині іншого типу, додають наповнювач (крохмаль, кухонну сіль, бентоніт) до стандартної активності і розфасовують у тару.

Відпрацьований спирт  зі збірки 13 насосом 14 подається в зміцнюючу колону 35, в якій він зміцнюється до 96% і через дефлегматор і холодильник 36 надходить у збірник 38. Втрати спирту заповнюють додаванням до збірки 38 свіжого спирту зі збірки 41.

 

1. Сепаратор типу ВСС-01

 

Сепаратор ВСС-01 (рис. 1.1)—осветлитель, тарельчатого типа, з автоматической выгрузкой осадка; он предназначается для очистки от твердой фазы суспензий с концентрацией твердой фазы не более 60% за об’ємом.

 

 

 

Рис. 1.1. Сепаратор ВСС-01 тарілчастий  з відцентровим пульсуючим вивантаженням  осаду (розріз).

Основними вузлами сепаратора є: станина 11; з приводом барабан 10; приймальновідводячій пристрій 1; приймач 6 для вивантажування осаду, в якому розташовані гальма барабана і стопори. Приймач має похиле дно для кращого сповзання осаду. Для цієї ж мети в ньому є стимулятор 9, через який подається вода в вивантажувальний осад.