Технология получение ГМО

Этот  же метод используется и при клонировании ДНК в экспрессируемых векторах (см. ниже).

Блот-гибридизация. При создании клонотек генов хромосомная ДНК фрагментируется с помощью рестриктаз. При этом неизвестно, содержат ли искомый ген сайт (или сайты) расщепления данной рестриктазой. Если такие сайты присутствуют, то выделить целый ген не удастся, и нужно использовать другую рестриктазу. Однако еще предварительно, без клонирования в бактериях можно исследовать структуру индивидуальных генов, определить наличие в них тех или иных сайтов рестрикции, установить число копий данного гена в геноме. Метод блот-гибридизации, используемый для этих целей, требует наличия соответствующей мРНК или кДНК.

Анализ  проводят следующим образом (рис. 3.14). Высокомолекулярную хромосомную ДНК расщепляют рестриктазой или их набором. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длинам электрофорезом в агарозном геле, и гель помещают на лист нитроцеллюлозы. После этого направление электрофореза меняется на перпендикулярное (в направлении листа). При этом ДНК из геля переходит на нитроцеллюлозу и получается как бы реплика с геля. Затем проводят гибридизацию на фильтре фрагментов хромосомной ДНК с зондом. Зонд гибридизуется только с теми фрагментами (полосами), которые содержат соответствующий ему ген. Полосы, с которыми связывалась метка, выявляют радиоавтографией.

Наличие на автографе одной полосы свидетельствует о том, что при реакции рестрикции ген не расщепляется, а интенсивность полосы дает возможность определить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный метод может оказаться очень полезным для анализа гена или семейства генов с целью выбора оптимальной стратегии клонирования.

Аналогичный метод разработан для анализа  клеточных мРНК с целью выяснения  их полного или частичного соответствия зонду, а также для определения их числа. Метод называется «Северный блотинг». Здесь электрофорез проводят не с фрагментами ДНК, а с молекулами РНК, которые в присутствии формальдегида также разделяются по размерам, а потом гибридизуются с зондом. Метод является полезным дополнением к технике клонирования ДНК, так как позволяет определить степень соответствия специфической ДНК зонду.

 

Итак, в  совокупности описанные методы в  том или ином сочетании позволяют получить практически любой ген, продукт которого — белок — известен и может быть выделен хотя бы в малом количестве. Этот ген в дальнейшем может стать объектом генно-инженерных манипуляций, задача которых получить его экспрессию в новом генетическом окружении.

Экспрессия генов

Генетические  элементы, регулирующие экспрессию генов.

Многие  бактериальные гены устроены таким  образом, что они способны функционировать  с существенно разной эффективностью. У Е. coli, например, относительное содержание различных белков варьирует в очень широких пределах (от менее чем 0,1% до 2%) в зависимости от их функций; при этом каждый белок в хромосоме Е. coli кодируется единственным геном. Такие вариации обусловлены действием системы контроля генной, экспрессии, которая осуществляется главным образом на уровне транскрипции ДНК. Таким образом, чаще всего уровень активности гена связан с количеством синтезируемой на нем мРНК, т. е. с активностью фермента РНК.полимеразы.

Последовательности  ДНК, расположенные перед началом  структурного гена и определяющие степень  активности РНК.полимеразы, называются регуляторными последовательностями (рис. 3.15). Одна из таких последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК.полимераза. Этот участок называется промотором. Последовательность оснований промотора определяет частоту инициации синтеза мРНК, причем замена одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз.

Регуляция экспрессии у Е. coli происходит также  и на уровне трансляции. Последовательность оснований длиной 6—8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ, определяет эффективность трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой. Как правило, он отстоит на 8 нуклеотидов от инициирующего кодона, и его сдвиг в ту или иную сторону может резко снижать эффективность трансляции соответствующей мРНК. Описанный участок называется последовательностью Шайна — Дальгарно, по имени исследователей, впервые его идентифицировавших.

 

У эукариотических  организмов механизм регуляции транскрипции гораздо более сложен. В результате клонирования и секвенирования генов эукариот обнаружены специфические последовательности, принимающие участие в транскрипции и трансляции. Эти последовательности по своей первичной структуре и расположению относительно инициирующего кодона отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК полимераза их не «узнает». Таким образом,

для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем прокариотических регуляторных элементов. Это обстоятельство необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии.

Экспрессируемые векторы. Экспрессия генов в бактериях. Для конструирования рекомбинантной ДНК, содержащей в своем составе ген, который должен экспрессироваться, придерживаются следующей стратегии. Синтезируют кДНК или из клонотеки выделяют клетки, несущие фрагмент генома с нужным геном, и клонируют их в соответствующем векторе. Фрагменты геномной ДНК подвергают модификации — удаляют из них некодирующие области и участки соседних генов. Часто для проведения этой операции необходимо секвенирование данного фрагмента ДНК. Затем конструируются промежуточные рекомбинантные ДНК, в которых ген помещается под контроль бактериальных регуляторных элементов (промотор, оператор, точка связывания с рибосомами). Эти регуляторные элементы выделяют специально для этой цели или из гибридных плазмид, сконструированных специально как источники регуляторных элементов. Полученная конструкция встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322 (рис. 3.16), и ген экспрессируется в бактериальной клетке.

 

Однако  удобнее встраивать ген в специальный вектор для экспрессии, который активную экспрессию после введения рекомбинантной плазмиды в бактериальную клетку. К таким эффективным регуляторным участкам относится, например, сильный промотор гена Р-лактамазы (это ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst 1, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена. В результате трансляции был получен химерный полипептид Р-лактамазаинсулин, из которого после удаления аминокислотной последовательности р-лактамазы удалось получить биологически активный инсулин.

Промотор  гена р-лактамазы нерегулируемый, а  использование таких промоторов не всегда удобно. Дело в том, что большое количество белка может блокировать рост бактерий. Кроме того, интенсивная транскрипция рекомбинантной ДНК может помешать репликации плазмиды, и она будет утрачена

3) гибридного trp-lac(tac)-npoMOTopa, который регулируется 1ас-репрессором.

Последовательность  Шайна — Дальгарно и расстояние от нее до инициирующего кодона существенным образом влияет на эффективность трансляции. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-kohцевых аминокислотных остатков происходят от прокариотического гена — источника регуляторных элементов и инициирующего кодона. Гибридные белки часто более стабильны, а химическая или ферментативная обработка позволяет выделить эукариотическую часть белка.

На эффективность  продуктивности рекомбинантной ДНК  в существенной степени влияет число  копий этой ДНК в расчете на клетку. Суммарная активность экспрессируемого гена растет с ростом копийности плазмиды. Таким образом, используя многокопийные плазмиды, можно достичь сверхсинтеза нужных белковых продуктов. Обычно используемые плазмидные векторы (pBR 322 и др

) поддерживаются  в клетке в количестве 20—50 копий.  Сейчас исследователи имеют в  своем распоряжении температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до одной-двух тысяч копий на клетку, не нарушая ее жизненно важных функций. Таким образом можно достичь сверхпродукции плазмидных генов бактериальными штаммами сверхпродуцентами. Это и представляет собой краеугольный камень биотехнологии, поскольку может давать существенный экономический эффект.

Клонирование  и экспрессия генов в бациллах и дрожжах. Успешное проведение генно-инженерных экспериментов на кишечной палочке — естественном обитателе кишечного тракта человека — стало стимулом для проведения аналогичных исследований с различными про- и эукариотическими организмами. Наибольших успехов в технологии рекомбинантных ДНК удалось достигнуть с клетками хорошо изученных организмов Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae.

В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм, который растет строго при аэробных условиях. Бациллы не образуют токсинов и не патогенны ни для животных, ни для растений, тогда как клеточная стенка Е. coli содержит эндотоксин — ли-полисахарид, который довольно трудно отделить от веществ — продуктов генной инженерии

Кроме того, клеточная стенка бацилл имеет  простую структуру, и бактерии могут  секретировать многие белки в  культуральную жидкость. Так, 20 различных  видов бацилл синтезируют в общей сложности более 40 ферментов с внеклеточной локализацией. Е. coli по сравнению с бациллами секретирует в среду относительно мало белков, что существенно затрудняет их выделение и очистку. В бациллах обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов. Эти векторы способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев, в данном случае—в В. subtilis и в Е. coli. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид В. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов бацилл. Существует, однако, проблема экспрессии чужеродной ДНК. Дело в том, что гены Е. coli со своими регу-ляторными районами не функционируют в В. subtilis, и для преодоления этого барьера необходимо использовать собственные (гомологичные) регуляторные районы. Таким образом в Е. coli были проклонированы гены trp-оперона, преинсулина, антигенов гепатита В, ящура и их белковые продукты синтезировались в В

subtilis. Дрожжи Saccaharomyces cerevisiae принадлежат к эукариотическим организмам, и организация их генетического аппарата гораздо сложнее, чем у Е. coli и В. subtilis. Этот вид наиболее полно исследован с генетической точки зрения. В гаплоидных клетках содержится 17 хромосом. Однако размер генома невелик, всего в четыре раза больше, чем у Е. coli. В составе хромосом идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной два микрона (так называемое 2 мкм-кольцо). Эта дрожжевая плазмида содержит примерно 6300 пар оснований и имеет примерно 50—100 копий на клетку.

Вследствие  сравнительно малого размера генома и короткого времени регенерации (несколько часов) экспериментировать с дрожжевыми клетками так же легко, как с большинством прокариот. Однако при этом можно исследовать весьма сложные генетические процессы, характерные для эукариот.

Процедура введения ДНК в клетки дрожжей  не представляет сложности. Целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами и получают так называемые «сферопласты»

х инкубируют с ДНК в присутствии СаС12 и  полиэтиленгликоля. При этом мембрана становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает  клеточную стенку.

Поскольку ряд генов дрожжей способен комплементировать мутации Е. coli, удалось достичь больших успехов в клонировании генов дрожжей. Для этого тотальную ДНК дрожжей после обработки рестриктазой клонируют в плазмиде и затем трансформируют этими плазмидами клетки Е. coll, несущие соответствующие мутации. Среди полученных трансформантов нетрудно отобрать те плазмиды, которые несут ген, комплементирующий мутацию. Затем плазмиды можно использовать для трансформации сферопластов мутантных штаммов дрожжей.

Однако  использование челночных векторов позволяет комплементировать мутации в самих дрожжевых клетках. Сконструированные челночные векторы содержат дрожжевой селективный маркер (Leu 3, his 3, ura 3 и т. п.), дрожжевой репликатор, обеспечивающий репликацию плазмиды в дрожжах, и бактериальный репликатор. Наиболее распространенные дрожжевые репликаторы выделены из 2 мкм-плазмиды дрожжей, хромосомной ДНК и митохондриальной ДНК.

Дрожжевую ДНК, расщепленную подходящей рестриктазой, клонируют в челночном векторе и размножают в Е. coll. Сферопласты дрожжей трансформируют смесью полученных плазмид. Плазмиды, комплементирующие мутацию в сферо-пластах-реципиентах, в селективных условиях можно отобрать, затем выделить и клонировать в Е. coli в больших количествах. Таким путем можно клонировать любой ген, для которого идентифицированы мутации.

С помощью  челночного гена удалось ввести гены лейкоцитарного интерферона человека в клетки дрожжей. Уже сконструирован штамм дрожжей, который выделяет в культуральную среду почти чистые а-, Р- и у-интерфероны. Для биологической активности интерферонов, которые представляют собой гликопротеины, существенно наличие углеводных групп. Клетки дрожжей, подобно клеткам млекопитающих, способны синтезировать такие группы и присоединять их к белковым молекулам. Бактериальные клетки таким свойством не обладают. Таким образом экспрессия генов млекопитающих значительно облегчает получение функционально активного продукта.