Технология получение ГМО

 

В последние  годы ученые используют новый под-ход  для получения трансгенных растений с “antisense RNA” (перевернутой или антисмысловой РНК), кото-рый позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180° . В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтези-руется [3]. Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным каче-ством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, кон-тролирующего синтез полигалактуроназы (polygalac-turonase) – фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного про-странства растительных тканей. Продукт гена PG син-тезируется в период созревания плодов томатов, а уве-личение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свой-ствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчи-вы к грибным заболеваниям. Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания то-матов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен – это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов [5, 7].

 

Таким образом, стратегия антисмысловых конст-рукций широко применима для модификации экс-прессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.

 

Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях – для изучения роли гормонов в раз-витии растений. Суть экспериментов заключалась в

 

получении трансгенных  растений с комбинацией опре-деленных бактериальных гормональных генов, напри-мер только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений [4, 5].

 

В последние  годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды транс-генных растений с геном iaaM, находящимся под про-мотором гена Def (ген, который экспрессируется толь-ко в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпиче-ские плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что поз-воляет решить проблему “лишних косточек”, например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

 

Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте  возможностей использования Ti-плазмиды аг-робактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно  используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерци-онного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном расте-ния, выключает ген, в который она встроилась, а по ут-рате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу об-наружить и клонировать соответствующий ген. В на-стоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены кло-нированы. В нашей лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу.

 

Областей применения трансгенных растений так много, что все имеющиеся сведения невозможно изло-жить в рамках одной статьи. На уровне лабораторных экспериментов  ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному содержанию солей и др. Трансгенные растения, устой-чивые к гербицидам (химическим соединениям, кото-рые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаме-нимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров [6]. Не менее интересен и другой аспект ра-бот – получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров – это получение растений петунии с разноцветными цветка-ми (рис. 6). На очереди голубые розы с геном, контро-лирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.

 

Итак, многие надежды  уже сейчас превратились в свершения, а агробактерия с ее удивительной Ti-плаз-мидой в руках ученых стала  настоящим инструментом как для  познания функционирования растительного

генома, так  и для решения многих проблем, которые стоят перед сельским хозяйством. К сожалению, в на-шей  стране трансгенные растения еще  остаются на уровне лабораторных экспериментов, поскольку доро-га от лаборатории  до поля, как и много лет назад, оста-ется непротоптанной, а во многих лабораториях, в том числе и в нашей, уже есть трансгенные растения, кото-рые ждут своего часа.

 

акие  же гены нужно клонировать и вводить  в растения, чтобы их улучшить? Наиболее целесообразно приобретение следующих признаков: устойчивость к холоду, засухе, повышенной засоленности почвы, т. е. к стрессовым воздействиям внешней среды, также полезна устойчивость к вредителям, гербицидам и пестицидам, резистентность к болезням, скороспелость и др. Определение и выделение генов, ответственных за эти признаки,— задача чрезвычайно трудная

Другая  проблема связана с введением  и адекватной экспрессией генов. Здесь основная задача связана с созданием векторных молекул и с разработкой метода прямого переноса генов. Сюда же входит задача отбора трансформированных клеток и обеспечение стабильного наследования приобретенного признака

Решение этих задач существенно облегчается  в связи с обнаружением природного генного вектора, возникшего в результате эволюции почвенных бактерий.

Наконец, третья проблема касается регенерации  трансформированных клеток или протопластов в целое фертильное растение. Дело в том, что регенерацию удалось получить для двудольных растений. Только для некоторых хозяйственно полезных растений удалось наладить методический цикл от протопласта до растения. Это картофель, люцерна, томаты, морковь, табак, капуста и др. Что же касается злаков, то регенерацию их клеток пока надежно осуществить не удалось.

Мы перечислили  основные проблемы, которые «лежат на поверхности», и трудно предсказать, какое множество препятствий встанет на пути исследователей.

Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды бактерий из группы агробактерий (Agrobacteria) могут заражать растения и вызывать при этом образование опухолей — корончатых галлов. Опухоли состоят из недифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. Почти все двудольные растения чувствительны к бактериям, а злаки и другие однодольные — нет

 

При культивировании  клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для роста нормальных растительных клеток. Если убить все бактерии антибиотиком, то клетки корончатых галлов сохраняют трансформированный фенотип. На примере одного из самых сильных индукторов опухолей — Agrobacterium tumefaciense— было пока зано, что собственно опухолеродным агентом является плазмида, часть которой встречается в хромосомах клеток растения (рис. 3.17).

 

Рис. 3.17. Т-ДНК, интегрируя в хромосому растения, индуцирует образование опухоли (корончатого  галла)

После трансформации клетки растения начинают синтезировать необычные аминокислоты — опины, которые используются бактериями в качестве источника азота и углерода. Таким образом образование опухоли сопровождается перестройкой метаболизма клеток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только для бактерий.

Плазмиды, вызывающие опухоли, называются Ti-плазмидами (от англ. tumor inducing — инициирующие опухоль). Это кольцевые молекулы длиной около 200 кб (3—5% от размера хромосомы агробактерии)

 

 

 

 бактериальных клетках  они реплицируются автономно. Ti-плазмиды различают по типу синтезируемого опина. Чаще всего встречаются плазмиды, кодирующие нопалин или октопин, причем клетка может содержать только один тип плазмиды: либо октопиновую, либо нопалиновую.

Генетические  исследования показали, что гены, ответственные за индукцию опухоли, синтез опинов и подавление дифференцировки, расположены близко друг от друга и входят в состав Ti-области плазмиды, которая встраивается в хромосому клетки при инфекции. Т-сегмент имеет длину около 20 кб (10% Ti-плазмиды) и встраиваются в различные, по-видимому неспецифичные, области хромосомы. На Т-области картировано семь генов, каждый из которых регулируется собственным промотором. Эти гены отвечают за синтез опина и за подавление дифференцировки клеток (подавление образования корней и побегов). Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию Т-ДНК, находятся не в Т-ДНК, а в области вирулентности (vir-область) (рис. 3.18).

 

Уникальные  биологические свойства Ti-плазмиды делают его идеальным вектором, естественным агентом для переноса генов

 

Она имеет  широкий круг хозяев, встраивает ДНК  в состав хромосомы, где она реплицируется и большая ее часть транслируется с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за Т-ДНК и перенесена в растительную клетку. Поскольку гены в составе К.ДНК имеют промоторы, то под их контроль можно поставить чужеродные гены. Однако из-за больших размеров манипуляции с Ti-плазмидой затруднены, вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется возможным.

Промежуточный и бинарный векторы. Один из способов введения чужеродной ДНК заключается  в использовании промежуточного вектора. Смысл подхода состоит в следующем (рис. 3.19). Сначала Т-ДНК с помощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. coli (например, pBR 322). Плазмиду с Т-ДНК размножают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefacience, несущие полную Ti-плазмиду

 

В результате двойного кроссинговера (гомологичной рекомбинации) между гомологичными районами Т-ДНК часть рекомбинантной плазмиды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti-плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Наконец, бактериями, имеющими Ti-плазмиду со встроенными генами, заражают растения и в результате получают клетки корончатого галла, которые будут содержать Т-область со встроенным в нее чужеродным геном.

Другой   распространенный метод введения чужеродной генетической информации заключается в использовании бинарных векторов. Оказалось, что для заражения и трансформации растительных клеток агробактериями необходима vir-область, ответственная за перенос ДНК и прямые повторы, ограничивающие Т-район. Более того, vir-область и ДНК, содержащая на концах пограничные повторы Т-района, могут находиться в разных плазмидах. Бактерии, содержащие Ti-плазмиду с vir-областью и другую плазмиду, в которой в Т-ДНК встроены любые гены, обеспечивают интеграцию последней в геном растения. Гомологичная рекомбинация для этого не требуется.

Однако  полученные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка

Если  же в гены, блокирующие дифференцировку, ввести мутации или вырезать их из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут  способность к регенерации. Так, ген алкогольдигидрогеназы (АДГ) дрожжей был встроен в область клонированной Т-ДНК, ответственную за подавление дифференцировки. Этой Т-ДНК трансформировали клетки табака, из которых затем удалось регенерировать целые растения, содержащие в геноме многочисленные копии АДГ — Т-ДНК. Растения были фертильными и в клетках потомства также содержались копии химерной ДНК (рис. 3.20).

В общем  случае для конструирования безвредного (для регенерации) вектора из Т-ДНК нужно удалить все ее собственные гены, оставив сигнальные прямые повторы и чужеродную ДНК.

 

 

Для того чтобы эта ДНК экспрессировалась  в растительных клетках, конструируют составной ген, в котором регуляторная область с промотором взята от одного из генов Т-области (например, гена нопалинсинтетазы, ответственного за синтез нопалина), а структурная часть представлена структурной частью гена, который нужно ввести в растение. Показано, что такие составные гены, будучи интегрированными в геном растения, хорошо экспрессируются под контролем нового промотора

Таким образом, проблема экспрессии генов в трансформированных растениях в принципе решена.

Векторы на основе ДНК.содержащих вирусов растений. Подавляющее большинство фитовирусов  в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Лишь 1—2% от числа вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК содержащим. Именно они наиболее удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для переноса генов в растения.

Наиболее  перспективным в этом отношении  и поэтому лучше изученным является вирус мозаики цветной капусты CaMV (cauliflower mozaic virus), поражающий в основном растения семейства крестоцветных. Частицы этого вируса имеют диаметр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8 кб. С вирионной ДНК транскрибируются не менее 80% информации, и, по крайней мере, некоторые из образовавшихся РНК являются матрицами для синтеза белков.

Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипулировать in vitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой, и затем вводить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как вирус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. При использовании 1—5 мкг клонированной ДНК для инфицирования одного растения посредством механической инокуляции достигается почти 100%-ная эффективность инфекции.