Морфология риккетсий. Патогенез, клиника, лабораторная диагностика

При всех формах инфекционного процесса у биопробных животных выявляют антитела к антигенам риккетсий в различных серологических реакциях (РА, РСК, РНИФ, ИФА). Используют цельнорастворимые и корпускулярные антигены из штаммов различных видов риккетсий. В большинстве серологических реакций отмечается выраженная перекрестная реактивность внутри групп (СТ и КПЛ). Для анализа антигенной структуры риккетсий чаще используют гипоиммунные сыворотки белых мышей и корпускулярные антигены.

При пассажах штаммов риккетсий  на морских свинках наиболее часто  используют 10 %-ные суспензии головного мозга и яичек, в ряде случаев также селезенок, надпочечников, реже - печени и почек (лихорадка Ку, крысиный сыпной тиф). При лихорадке цуцугамуши, крысином и осповидном риккетсиозах, лихорадке Ку для изоляции возбудителя можно применять белых мышей. Их заражают внутрибрюшинно 10 %-ными суспензиями риккетсиальных материалов в объеме 0,5 мл. Летальность у мышей чаще отмечают при заражении O. tsutsugamushi, R. akari, реже - R. typhii.

При подкожном заражении морских  свинок и белых мышей Coxiella burnetii характерно образование подкожного инфильтрата на месте введения с накоплением коксиелл. В ряде случаев при экспериментальных риккетсиозах воспроизводят тестикулярные, легочные, перитонеальные и глазные формы инфекционного процесса.

Культивирование в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов  более эффективно для накопления риккетсий по сравнению с биопробными животными. Однако первичное выделение штаммов риккетсий на куриных эмбрионах проводят редко в связи с высокой вероятностью контаминации посторонней микрофлорой, преимущественно для выделения гемокультур. Обычно куриные эмбрионы при выделении штаммов заражают пассажным материалом от зараженных лабораторных животных (чаще - суспензии тестикул, селезенок, головного мозга).

По результатам овоскопии для заражения отбирают нормально развившиеся куриные эмбрионы с характерным сосудистым рисунком. Заражение проводят с соблюдением строгих асептических условий в специальном стерильном боксе. После дезинфекции спиртом, затем йодной настойкой с последующей обработкой смоченной спиртом поверхности куриного яйца пламенем через пробуравленное в скорлупе отверстие над вершиной воздушной камеры проводят заражение риккетсиальной суспензией в объеме до 0,5 мл проколом в полость желточного мешка. Отверстие в скорлупе герметизируют расплавленным стерильным парафином. Для контроля на стерильность суспензии для заражения параллельно высевают на специальные среды сахарный бульон, тиогликолевая среда, среды для выявления контаминации микоплазмами).

Для культивирования риккетсий  группы КПЛ используют 4-5-суточные эмбрионы, для риккетсий группы сыпного  тифа и ориенций - 6-7-суточные, для коксиелл Бернета - 7-8-суточные. Зараженные яйца помещают в термостат при влажности 45-60 % и инкубируют при оптимальной для каждой группы риккетсий температуре до специфической массовой гибели эмбрионов. Оптимальной температурой для накопления риккетсий группы сыпного тифа, ориенций и R. akari является +35°С, риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок +33 °С.

При культивировании учитывают  сроки гибели зараженных эмбрионов, видимые изменения (геморрагические  поражения), интенсивность накопления риккетсий. Погибшие в течение 3 суток  после заражения эмбрионы отбраковывают (неспецифические проявления, чаще - травматическая гибель). При дальнейшей ежедневной овоскопии отбирают для вскрытия погибшие эмбрионы (отсутствие подвижности эмбрионов, утрата сосудистого узора). Куриные эмбрионы вскрывают в стерильных условиях, извлекают желточные мешки, которые и используют для дальнейших пассажей. Параллельно делают мазки из сосудов желточного мешка для световой и люминесцентной микроскопии (определение накопления риккетсий, контаминации посторонней микрофлорой).

Гибель эмбрионов при культивировании риккетсий группы сыпного тифа наступает в более поздние сроки (6-10-е сутки после заражения, иногда и позже), чем риккетсий группы КПЛ (4-6-е сутки), сопровождается более интенсивным накоплением риккетсий при менее выраженных изменениях геморрагического характера. Заражение куриных эмбрионов коксиеллами Бернета вызывает относительно позднюю гибель эмбрионов (6-8-е сутки) при интенсивном размножении возбудителя без выраженных изменений самого эмбриона.

Для культивирования риккетсий  могут быть использованы как первично трипсинизированные, так и перевиваемые культуры клеток. Большинство видов риккетсий размножается в культурах клеток почечного эпителия, мезотелия, перевиваемых линиях клеток Vero, HeLa, Нер-2, L929. Коксиеллы Бернета хорошо размножаются также в культурах фибробластов куриного эмбриона и морских свинок, макрофагов и ретикулярных клеток костного мозга и селезенки. Получены данные о возможности культивирования на культурах клеток Vera и Нер-2 риккетсий, не культивируемых на традиционных моделях - морских свинках и куриных эмбрионах (R. tarasevichiae, риккетсий подгруппы R. massiliae).

Для пассирования культуры клеток подвергают версенизации по стандартной методике. Культуры клеток Vero и Нер-2 выращивают в стеклянных флаконах, засев проводят в концентрации 150 тыс. клеток на 1 мл. В качестве питательной среды используют среду Игла MEM с двойным набором аминокислот, к общему объему добавляют до 10 % эмбриональной сыворотки. Подготовленные флаконы заражают 10 %-ной риккетсиальной суспензией в объеме 0,5 мл на флакон. Зараженные флаконы центрифугируют при 800 об/мин при температуре +22 °С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением эмбриональной сыворотки до 1 %) в объеме 1,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 35,6 °С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике на -20 °С, а потом оггаиванию для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После оггаивания материал центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, супернатант в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому - Гимзе, и методом флюоресцирующих антител. Отсутствие посторонней микрофлоры в пассажах контролируется также посевом на питательные среды (сахарный бульон, тиогликолевая среда, среда Сабуро, среды на микоплазмы).

Развитие инфекции в клеточных  культурах у различных видов  родов Rickettsia и Orientia отличается. Для риккетсий Провачека и ориенций цуцугамуши характерно накопление микроорганизмов в больших количествах в отдельных клетках. Дегенеративные изменения клеток вследствие перепроизводства возбудителя сопровождаются их разрывом и освобождением микроорганизмов с распространением инфекции на соседние клетки.

У риккетсий группы КПЛ накопление возбудителя в отдельных клетках  не сопровождается их переполнением, риккетсий  еще на ранней стадии выходят из клеток без существенных их повреждений  с быстрым распространением инфекции клеточной культуры. Дегенеративные изменения клеток обусловлены преимущественно  токсическим действием риккетсий.

Методы выделения и последующей идентификации риккетсий требуют специальной подготовки, соблюдения режимных требований (возбудители 2-3-й группы патогенности). К возбудителям второй группы патогенности относят R. prowazekii, Coxiella burnetii, R. rickettsii. Их культивирование можно осуществлять в специализированных риккетсиологических лабораториях или лабораториях особо опасных инфекций, что ограничивает возможности использования методов выделения риккетсий в диагностических целях.

При изучении штаммов риккетсий  придерживались классической схемы  дифференциации, предложенной П.Ф. Здродовским и Е.М. Голиневич (1972), которая включает: 
а) изучение морфологии; 
б) характеристику размножения при культивировании в желточных мешках куриных эмбрионов; 
в) воспроизведение экспериментальной инфекции на лабораторных животных; 
г) иммунологическую характеристику в опытах перекрестного иммунитета; 
д) серологический анализ антигенной структуры.

В последние годы выявлен ряд  новых риккетсий, не культивируемых на традиционных риккетсиологических моделях (лабораторные животные, куриные эмбрионы). Для их культивирования использована клещевая экспериментальная модель (воспроизведение естественного цикла развития иксодид) и длительно культивируемые линии клеток млекопитающих (Vera, Нер-2) и иксодовых клещей.

Для группоспецифической идентификации  риккетсий группы КПЛ можно использовать РСК с сыворотками крови биопробных морских свинок и цельнорастворимыми антигенами оригинальных штаммов риккетсий и музейных штаммов известных видов. Дифференциация риккетсий группы КПЛ ранее базировалась преимущественно на учете их токсических свойств, а также использовании корпускулярных антигенов и иммунных мышиных сывороток для идентификации риккетсий. Можно использовать метод флюоресцирующих антител с мазками-отпечатками желточных мешков куриных эмбрионов, ИФА и РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ и сыпного тифа производства Пермского филиала ФГУП «НПО «Микроген».

Дальнейшая идентификация проводится в перекрестной РСК с сыворотками  мышей СВА и набором антигенов  риккетсий, в РНИФ с моноклональными антителами к риккетсиям, а также с помощью генетических методов (рестрикционный анализ ДНК, ДНК-зондирование, полимеразная цепная реакция с использованием праймеров области гена цитратсинтазы и белкового антигена 190 кДа с последующим определением нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов ДНК и др.).

Серологическая диагностика

Реакцию Вейля - Феликса (см. раздел «Антигенное  строение риккетсий») с протейными антигенами и варианты реакции агглютинации со специфическими риккетсиальными антигенами в настоящее время практически не применяют в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью. Существует более чувствительный метод микроагглютинации с меченными флюорохромом риккетсиями для серодиагностики риккетсиозов группы СТ производства Пермского филиала ФГУП «НПО «Микроген», однако не нашедший широкого применения в практике.

В течение многих десятилетий РСК  являлась базовым методом серологической диагностики риккетсиозов. Метод  обладает высокой групповой специфичностью даже при низких (1:10-1:20) разведениях  сывороток, однако недостаточно чувствителен в ранней фазе заболевания. Комплементсвязывающие  антитела при большинстве риккетсиозов групп СТ и КПП выявляют в конце первой - начале второй недели инфекции, в некоторых случаях - в более поздние сроки. Наличие группоспецифического полисахаридного комплекса в составе препарата растворимого антигена для РСК приводит к отсутствию четкой видовой дифференциации внутри групп СТ и КПЛ, хотя титры антител обычно бывают выше к гомологичному антигену. Группоспецифическая диагностика риккетсиозов группы КПЛ в РСК в России осуществляется с растворимым антигеном R. sibirica, в Америке — R. rickettsii, в Европе - R. conorii, что определяется распространением важнейших риккетсиозов этой группы - клещевого сыпного тифа Северной Азии, пятнистой лихорадки Скалистых гор и марсельской лихорадки соответственно. Более четкая видовая дифференциация внутри групп осуществляется с помощью корпускулярных антигенов, однако чаще не в РСК, а в РНИФ. Антигены и другие ингредиенты для РСК выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген».

Реакцию непрямой гемагглютинации  применяют для диагностики риккетсиозов как группы СТ, так и группы КПЛ. В качестве гемосенситина используют комплекс ЛПС и белковых антигенов. В нашей стране метод применяется преимущественно для выявления антител к риккетсиям группы СТ. Препарат выпускают в Пермском филиале НПО «Микроген». РНГА - наиболее ранний, чувствительный метод выявления текущей (острой) риккетсиоз-вой инфекции, выявляет преимущественно IgM-антитела, быстро исчезающие после перенесения инфекции. Латекс-агглютинация в целом близка по своим параметрам к РНГА, используется как метод первичного тестирования сывороток крови, группоспецифична, выявляет как IgM-, так и IgG-антитела, в связи с высокой перекрестной реактивностью внутри группы СТ не позволяет дифференцировать эпидемический и эндемический сыпной тиф.

Иммуноферментный анализ применяют  для серодиагностики риккетсиозов групп СТ и КПЛ, лихорадки цуцугамуши. Применяют различные варианты ИФА с использованием ренографиночищенных антигенов для сенсибилизации планшет. По чувствительности и специфичности ИФА сопоставима с РНИФ, однако имеет некоторые преимущества для выявления антител в низких титрах (у вакцинированных, в период поздней реконвалесценции), что можно использовать при ретроспективном эпидемиологическом анализе. В России выпускают тест-системы ИФА для выявления антигенов коксиелл Бернета и антител к ним (Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера).

В последние годы в Омском НИИ природно-очаговых инфекций разработан ИФА для выявления антител к риккетсиям группы КПЛ, показана эффективность применения ИФА с антигеном R. sibirica для диагностики клещевого риккетсиоза (Н.В. Абрамова и др., 2009,2010).

Реакция непрямой иммунофлюоресценции считается «золотым стандартом» серодиагностики риккетсиозов, используемым в большинстве лабораторий. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, воспроизводимостью, позволяет выявлять IgM- и IgG-антитела как вместе, так и раздельно в зависимости от применяемых конъюгатов. При риккетсиозах группы КПЛ и лихорадке цуцугамуши диагностически значимые титры IgM-антител выявляют в конце первой недели, IgG-антител - в конце второй недели заболевания. В России корпускулярных антигенов для РНИФ не выпускают, экспериментальные серии производят НИИЭМ им. Гамалеи РАМН, Омский НИИ природно-очаговых инфекций, Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера.

Методом подтверждения стандартных  серологических методов диагностики  является иммуноблот. Показано, что перекрестно-реагирующие антитела направлены против ЛПС и относятся к IgM-антителам, IgG-антитела образуются как к ЛПС, так и к белковым антигенам риккетсий. Коммерческие наборы для иммуноблота находятся в стадии разработки.

Диагноз лихорадки Ку вследствие полиморфизма клиники невозможен без лабораторного  подтверждения. Основной метод - РСК. Наряду с ним используют более чувствительные методы - РНИФ и ИФА. У больных  преобладают антитела к антигену C. burnetii фазы 2; антитела к антигену фазы 1 преобладают при формировании хронического течения.

Молекулярно-биологические  методы

Генетические методы находят все  более широкое применение для  изучения и идентификации риккетсий. Среди них используют анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ), метод геномной дактилоскопии (ДНК-зонды), анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированной в полимеразной цепной реакции ДНК (ПДРФ аДНК ПЦР), пульсовый гелевый электрофорез, метод сравнения нуклеотидных последовательностей.