Молекулярная биология

обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации

увеличивается с ростом температуры  за счет ускорения образования свободных  радикалов. Этим можно воспользоваться  для

замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее продолжительность  увеличивается примерно на 2 мин. Полимеризацию  гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести

на холоду.

    Гель получается  наиболее однородным, если время  полимеризации составляет 30 — 40 мин.  Обычно этого добиваются эмпирически,  подбирая оптимальную концентрацию  персульфата. Она может варьировать  в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимости  от концентрации акриламида и  качества самого персульфата.  С увеличением содержания акриламида  концентрацию персульфата приходится  уменьшать. Имеет смысл предварительно

внести различные количества данного препарата персульфата

в ряд пробирок с рабочим  раствором мономеров акриламида,

наблюдая продолжительность  полимеризации в них.

Выбор концентраций мономеров

   Для удобства изложения  используются следующие обозначения:  Т — процентное отношение суммарной  массы обоих мономеров к объему  их раствора, С — процентное  отношение массы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Величина Т практически варьирует в пределах 3 — 30%, а С, как правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акриламид/Бис в пределах от 99:1 по 19:1.Однако в некоторых

особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать

С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» далее будет опущен. Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3 — 5), т. е. отношение акриламид/Бис брать в пределах от 35:1до20:1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы «замыкается». Мелкопористые гели (T около 20) при высоком

содержании «сшивки» оказываются  хрупкими и мутными, по-

этому для них величина С не должна превышать 1 — 2.

    Неправильно было  бы считать ПААГ регулярной  пространственной решеткой с  жесткими ячейками определенного  среднего размера. При малых  значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь вот дельных точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние между этими точками вдоль нити (при C  2) в среднем равно

50 — 100 мономерных единиц. Такая система не может быть

внутренне жесткой. Мигрирующие  в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные  участки линейных

полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энергия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное «трение» их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих  молекул такая система не накладывает, и это очень существенно.

    Чем больше  содержание акриламида, тем гуще  нити полимера, меньше промежутки  между ними и сильнее трение. Увеличение содержания

«сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, так как средняя  длина свободных участков нитей  уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется, — именно этого и можно было ожидать.

Возвращаясь к ПААГ, следует  указать, что гели с очень высоким  содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки,

легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.

Этих недостатков лишены гели, сшитые NN/-диaллилтapтapдиaмидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказывается настолько крупно пористым, что не тормозит миграцию биополимеров с молекулярной массой 0,5млн. дальтон; при этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и прозрачен. Вспомним, что такой гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано успешное использование для электрофореза белков еще сильнее сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27,т.е. отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1.

        Рассмотрим  теперь подробнее влияние выбора  значений Т и

С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополимеров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении

электрофоретической подвижности  заряженных макромолекул в

геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидкости с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной силы раствора (u0).

         Электрофоретическую подвижность  определяют как величину скорости  миграции заряженных молекул(см/ч)при напряженности поля 1 В/см. Величина и0 зависит от соотношения суммарного электрического заряда макромолекулы(при данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в электрическом поле, пропорциональна заряду, а противодействующая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жидкость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следовательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки заметим, что электрофоретическая подвижность большинства кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пределах 0,1 — 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между массой молекулы и величиной и0, очевидно, быть не должно.

        В  геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,

чем больше масса молекул  и меньше средний размер пор, т. е.

чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что

имеет место соотношение: ln(и'/и0) = — kRT. Величина коэффициента торможения kR (порядка 0,1— 0,4) зависит от среднего

радиуса молекулы R и степени  сшивки геля С, слабо увеличиваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобулярных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).

     Для эффективного  разделения белков при электрофорезе  в

ПААГ соотношение u'/u0 должно составлять 0,1 — 0,2. Отсюда

следует, что оптимальная  электрофоретическая подвижность

белков в ПААГ лежит  в пределах 0,01— 0,1 см/ч на 1 В/см. При

напряженности поля 10  —  20 В/см этому соответствуют скорости

миграции белков в диапазоне 0,1 — 2 см/ч. Таким образом, при

рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быстрые  белки могут достигнуть конца  геля, в то время как наименее

подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо

приближенные и приведены  здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения

от них. Например, если заранее  известно, что разделяемые белки  сильно различаются между собой  по заряду или размерам, то

можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей (и'), т. е. в более крупно пористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2 — 3 раза.

         Выбор значения Т зависит от природы различия электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить только за счет трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза

усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой

смеси имеют различные  отношения заряда к массе, то может

оказаться выгодным вести  разделение в крупнопористом геле при  малых значениях Т), т.е. как бы в свободной жидкости, почти не используя эффект трения молекул  о гель. По крайней мере, это обеспечит  выигрыш во времени фракционирования.

 

Миграция белков в геле

      Отличие  и' от uо  является сила трения о гель, которая зависит от соотношения линейных размеров макромолекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляющего большинства индивидуальных белков не превышают 500 000.

Поэтому использование гелей  агарозы оказывается нецелесообразным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести только по величине отношения заряда к массе. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5 — 20% акриламида.

       Белки  являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим.

       Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обусловливает не максимальный заряд, а максимальное различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэтому в большинстве случаев нецелесообразно использовать экстремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленны не от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются

в нейтральной или слабощелочной  области; миграция белков

идет в направлении  от катода к аноду. Для щелочных белков

(гистонов, белков рибосом  и др.) целесообразно использовать

слабокислые буферы (рН 4 — 5). Эти белки различаются по величине суммарного положительного заряда и мигрируют в направлении от анода к катоду.

   Отметим, что эффект  трения о гель зависит не  только

от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости  белковой макромолекулы. Глобулярные  белки, неспособные к агрегации  или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или менее  одинаково, хотя их размеры зависят  от плотности упаковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные белки могут деформироваться  при взаимодействии с гелем и  тем самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эффект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеиновых кислот.

        Для  однозначного определения молекулярной  массы белка

по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесообразно  распрямить полипептидную цепочку  белка и придать ей

жесткость. Именно такой  прием используется при электрофорезе  белков, обработанных додецилсульфатом натрия.

Красители используемые для проявления белков

 

      Для наблюдения  за ходом электрофореза в исходный  препарат вносят краситель, мигрирующий  в том же направлении, что

и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом связываться  с белками, а скорость его продвижения  по гелю должна быть заведомо больше, чему наиболее быстро мигрирующего белка. Вместе с тем краситель не должен слишком  сильно отрываться от белков, чтобы  его прохождению до конца пластины или трубки соответствовало использование  большей части

находящегося в них  геля для фракционирования белков.

      В щелочных  и нейтральных буферах, когда  кислые белки заряжены отрицательно  и мигрируют к аноду, а также  для любых

белков в комплексе  с ДДС-Na используют отрицательно заряженные красители. Наибольшее распространение получил Бромфеноловый синий, имеющий достаточно сложную структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфенольных остатка. Иногда используют еще более сложно построенный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвижность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового синего, поэтому его используют при фракционировании крупных белков и нуклеиновых кислот.

 

       Для  характеристики электрофоретической  подвижности белка в данных  условиях электрофореза принято  указывать отношение расстояния, пройденного белковой полосой  от начала рабочего геля, к  аналогичному расстоянию до полосы  красителя в этом же геле. Это  отношение, как и в хроматографии,  обозначают Rf В качестве положительно заряженного красителя для электрофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении катода, используют метиловый зеленый или пиронин.

 

Заключение

        В  ходе работы было изучен метод  электрофореза белков. Использование  метода электрофореза в полиакриламидном  геле для анализа и разделения  сложных смесей белков и нуклеиновых  кислот значительно расширило  наши знания о белках. Электрофорез  в полиакриламидном геле имеет  ряд преимуществ перед другими  аналитическими методами: он отличается  простотой в исполнении, хорошей  воспроизводимостью результатов и не требует сложного оборудования.

 

Список литературы

   1. http://ru.wikipedia.org

   2. http://www.molbiol.ru

   3. http://molbiol.ru

   4. http://www.ippras.ru

   5. Электрофорез и  ультрацентрифугирование (практическое пособие). Методы исследования белков и нуклеиновых кислот (Остерман)

   6. Ларский Электрофорез Г., Методы зонального электрофореза, М., 1971

   7. Духин С. С., Дерягин Б. В., Электрофорез, М., 1976.