Молекулярная биология

         В этом случае решающее влияние  на электрофоретическую подвижность  различных макромолекул и степень  разделения оказывает соотношение  их линейных размеров. Возможна  даже такая ситуация,

когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кис-

лот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их

миграция прекратится.

         В настоящее время почти исключительно  используются полиакриламидные  гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.

 

Варианты метода электрофореза  белков

 

         Существует множество разновидностей  и модификаций данного метода, которые используются (или использовались  в определённые периоды развития  биохимии) в различных областях:

   1) электрофорез в  свободных средах (без поддерживающей  среды) 

   2) электрофорез с  подвижной границей

   3) зональный электрофорез  без поддерживающей среды

   4) капиллярный электрофорез

   5) зональный электрофорез  в поддерживающей среде с капиллярной  структурой 

   6) электрофорез на  фильтровальной бумаге

   7) электрофорез белков  на ацетат-целлюлозной мембране

   8) электрофорез в  колонках и блоках гранулированной  поддерживающей среды

   9) электрофорез белков  в ПААГ

   10) электрофорез белков  в крахмальном геле

   11) электрофорез белков  в агарозном геле

   12) электрофорез в  полиакриламидном геле

 

Список необходимого оборудования для Электрофореза

 

       Для  проведения практикума необходима  лаборатория (примерная площадь  - 20 м х 20 м) оснащенная следующим оборудованием и расходными материалами:

   1. Вертикальная камера  для электрофореза с комплектующими;

   2. Источник питания  с регулировкой силы тока или/и  напряжения;

   3. Система гель-документирования;

   4. Холодильник (+4º), с морозильной камерой (-20º)  для хранения растворов;

   5. Электронные аналитические  весы и набор шпателей для  взвешивания;

   6. Система для получения  деионизированной воды (milliQ);

   7. Магнитная мешалка  с набором магнитных якорей;

   8. Мерные цилиндры (100 и 500 мл), мерные стеклянные  стаканы.

   9. Стеклянные бутыли  для хранения растворов.

   10. Один комплект  пипеток-дозаторов (10, 200 и 1000 мкл);

   11. Пробирки конусные (15 и 50 мл), пробирки типа эппендорф (0,5 и 1,5 мл), наконечники для пипеток (20, 200, 1000, 5000 мкл).

   12. Список необходимых  реактивов: акриламид, N,N' –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, трицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, Бромфеноловый синий, Кумасси R 250, Кумасси G 250, изопропанол, уксусная кислота, глутаровый альдегид, набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) и набор низкомолекулярных маркеров молекулярных масс белков и пептидов (1-30 кДа).

 

Форезная камера

 

       Форезные камеры бывают двух типов: с двумя или с одним платиновым электродом.

 

* камеры с двумя платиновыми  электродами можно подключать  к источнику напряжения в любой  полярности.

* камеры с одним - только  одним способом!!! Обычно на таких  камерах указана полярность подключения.  Будьте внимательны.

Подготовка камеры:

мыть губкой, смоченной  детергентом;

сполоснуть раз 10 водопроводной  водой;

сполоснуть раза 2-3 дистиллятом.

Форезные камеры имеют два уязвимых места:

 

* сравнительно легко при  мытье отодрать платиновый электрод;

* если при споласкивании  или переносе держать камеру  за один бортик, то в этом  бортике появится трещина.

 

 

рис 2. Прибор для электрофореза

в вертикальных трубках (в  разрезе)1 — верхний электродный  резервуар;

2 — центральный цилиндр; 3 — верхний

платиновый электрод; 4 —  резиновая

прокладка; 5 — трубочка с  гелем; 6 —

нижний электродный резервуар; 7 —

нижний платиновый электрод.

         Для электрофореза белков обычно  используют пластины шириной  8 — 14 см и длиной (в направлении  электрофореза) 8 —28 см. Электрофорез  нуклеиновых кислот и их фрагментов, например при секвенировании, нередко ведут в больших пластинах размером 33  43 см, что диктуется максимальным размером рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гидролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины

ПААГ длиной 90 см

 

Плотность Геля

 

        Стандартно  используют следующие обозначения:

Т – процентное отношение  суммарной массы обоих мономеров  к объему раствора,

С – процентное отношение  массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С):

 

      Т = (a + b)/m  x  100 %

 

      C = b/(a + b)  x  100 %

 

a – количество акриламида;

 

b – количество мономера, образующего сшивки (бисакриламида);

 

m – объем буфера, мл.

 

         Т обычно варьируется в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина С не должна превышать 1-2%.

         На первый взгляд чем больше Т, тем мельче поры, но это не всегда так, поскольку ПААГ не является регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайно сшитые между собой. Такая система не может быть внутренне жесткой. Поэтому мигрирующие в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида, при этом миграция молекул замедляется и происходит своеобразное трение их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно.

         Чем выше концентрация заполимеризованного акриламида, тем меньше размер пор в геле: p = 1,5 d / Ö` c

где р – размер пор в ангстремах

 

       c – объемная концентрация акриламида

 

       d – диаметр молекулы акриламида

 

        Чем  больше содержание акриламида (а  величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением С выше 10% тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С>15% гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки С в геле должно быть в пределе 2-5%.

        Соотношение  между акриламидом и сшивающим  агентом определяют механические  и физические свойства геля. Для  гелей с концентрацией Т  5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %. Для выбора С была предложена следующая эмпирическая формула:

С (%) = 6,5 – 0,3 Т (%)

 

Концентрация полиакриламидных гелей, используемых для разделения макромолекул с различными молекулярными  массами

 

 Концентрация геля Т, % | Концентрация бисакриламида С, % | Пределы разделения, дальтоны |

15-2010-155-1052-5 | 0,20,32 – 356 | 1 х 104    -   4 х 1044 х 104   -   1 х 1051 х 105  -    3 х 1053 х 105  -   5 х 105выше  5 х 105 |

 

ГЕЛИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

 

ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ ГЕЛЬ (ПААГ)

 

Исходные материалы

 

         Акриламид (СН2 = СН — CONH2) представляет собой белый

кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный препарат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный

водный раствор должен иметь рН не ниже 5, а оптическая плотность 1%-ного раствора при 290 нм (А290) не должна превышать

0,15. Такой препарат можно  использовать без дополнительной

очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить

сухим, в темной посуде, предпочтительно  на холоду. В этих условиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воздействует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и растворять его следует в перчатках и под тягой.

         Недостаточно чистый препарат  можно перекристаллизовать.

Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при

50°, фильтруют при этой  же температуре, затем охлаждают  до

— 20°, быстро промывают  кристаллы холодным хлороформом  и

высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-поглощающих примесей акриламид можно обработать активированным углем. Для этого в маточный 30 — 40%-ный водный раствор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемешивают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а затем через стекловолокнистый фильтр.

    NN'-Метиленбисакриламид («Бис»)  — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров акриламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02% акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке.

В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из

ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия

хранения и токсичность  — такие же, как у акриламида.

        В  качестве «сшивки» иногда используют  этилендиакрилат —

СН2 = СН — СО — O — СН2 — СН2 — О — СО — СН = СН2, а также

NN'-диаллилтартардиамид   (ДАТД) — CH2 = CH — CH2 — NH —

CO — CH(OH) — CH(OH) — CO — NH — CH2 — CH = CH2. С их помощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную

связь можно разорвать  обработкой геля щелочью или водным

раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за

20 — 30 мин при комнатной  температуре в 2%-ной йодной  кислоте. 

 

Процесс полимеризации ПААГ

        При  подготовке определенной серии  опытов удобно заранее

приготовить концентрированный (30 — 40%) водный раствор акриламида и метиленбисакриламида с определенным соотношением обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточный раствор буфера, например 10-кратной концентрации.

        ТЕМЕД  хранится хорошо, а персульфат  аммония растворяют в

воде непосредственно  перед началом опыта.

    Для приготовления  геля маточные растворы мономеров  и буфера смешивают в такой  пропорции, чтобы получить нужную  конечную концентрацию акриламида  и буфера, дополняют до расчетного  объема водой и вносят ТЕМЕД.  После этого раствор деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и заливают в трубку или между стеклами для формирования пластин. При правильном выборе концентраций персульфата и ТЕМЕД полимеризация занимает 30 — 40 мин.Ее следует вести вдали от яркого источника света.

    Рассмотрим некоторые  факторы, влияющие на этот процесс.

Наибольшую опасность  для нормального протекания полимеризации  акриламида представляет растворенный в воде кислород,

молекула которого является определенного рода бирадикалом

и потому способна оборвать цепную реакцию свободно-радикальной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов

необходима именно для удаления из нее растворенного кислорода. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием —

так, чтобы жидкость при  пониженном давлении закипела, но

как только интенсивное выделение  пузырей газа закончится,

деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испарения  воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при

комнатной температуре.

         Кислород воздуха в контакте  с раствором мономеров может

помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора осторожно наслаивают до высоты 3 — 5 мм деаэрированную кипячением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке формы через иглу от шприца с помощью перистальтического насоса. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем вновь появляется, что указывает на окончание процесса полимеризации. Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то форму с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой «дневного света» с расстоянияоколо5смвтечение30 — 45мин. Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распада не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как ион персульфата может вступать в реакцию с белками, создавая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда

это существенно, персульфат удаляют путем предварительного

электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него

препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не менее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отдают персульфату, поскольку при работе с рибофлавином довольно трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования растворов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом количестве, для самого процесса инициации с участием рибофлавина. Полимеризация — экзотермический процесс, поэтому в случае высокой концентрации акриламида во избежание образования пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо