Молекулярная биология

МОЛЕКУЛЯРНАЯ  БИОЛОГИЯ, изучает явления жизни  на уровне макромолекул в бесклеточных структурах (рибосомы и др.), в вирусах, а также в клетках. Цель молекулярной биологии - установление роли и механизма функционирования этих макромолекул на основе знания их структуры.

Исторически молекулярная биология сформировалась в ходе развития направлений биохимии, изучающих биополимеры. В то время  как биохимия исследует глобальным образом обмен веществ и биоэнергетику, молекулярная биология уделяет главное  внимание изучению способа хранения наследственной информации, механизма  ее передачи дочерним клеткам и реализации этой информации. Молекулярная биология - пограничная наука, возникшая на границе биохимии, биоорганической  химии, биофизики, орг. химии, цитологии  и генетики. Формальной датой возникновения  молекулярной биологии считают 1953, когда  Д. Уотсон и Ф. Крик установили структуру  ДНК и высказали подтвердившееся  позже предположение о механизме  ее репликации (удвоении), лежащем в  основе наследственности. Таким образом, были увязаны функции этого биополимера (тот факт, что ДНК-фактор наследственности, установлен в 1944 О. Эйвери) с его химической структурой и свойствами. Важное значение для становления молекулярной биологии как науки имели также работы по изучению молекулярных основ мышечного сокращения (В. А. Энгельгардт и М. И. Любимова, с 1939).

По  истокам своего развития молекулярная биология неразрывно связана с молекулярной генетикой (наука, изучающая структурно функциональную организацию генетического  аппарата клеток и механизма реализации наследственной информации), которая  продолжает составлять важную часть  молекулярной биологии, хотя и сформировалась уже в значительной мере в самостоятельную  дисциплину. Именно в этой области  были достигнуты результаты, которые способствовали развитию молекулярной биологии и восприятию ее принципов.

Для понимания закономерностей строения нуклеиновых кислот и их поведения  в клетке важнейшее значение имеет  принцип комплементарности пуриновых и пиримидиновых оснований, установленный в 1953 Уотсоном и Криком. Признание значения пространственных отношений нашло свое выражение также в представлении о комплементарности поверхностей макромолекул и молекулярных комплексов, что является необходимым условием проявления слабых сил - не валентных взаимодействий (водородные связи и др.), действующих лишь на коротких расстояниях и создающих морфологическое разнообразие биологических структур, их функциональную подвижность. Не валентные взаимодействия обусловливают образование фермент-субстратных комплексов, самосборку биологических структур, рибосом, и др.

Важное  достижение молекулярной биологии - раскрытие  на молекулярном уровне механизма мутаций. Главную роль в нем играют выпадения, вставки и перемещения отрезков ДНК, замены пары нуклеотидов в функционально  значимых отрезках генома. Определена важная роль мутаций в эволюции организмов (в СССР инициатором исследований молекулярных основ эволюции был  А. Н. Белозерский). Раскрыты молекулярные основы таких генетических процессов  у прокариот (бактерии и сине-зеленые водоросли) и эукариот (все организмы, за исключением прокариот), как рекомбинация генетическая - обмен участками хромосом, приводящий к появлению бактерий (вирусов) с новым сочетанием генов. Достигнуты значительные успехи в изучении строения клеточного ядра, в т.ч. хромосом эукариот. Была развита идея о репликоне (элементарная генетическая структура, способная к репликации как единое целое), объясняющая важные аспекты регуляции репликации (Ф. Жакоб и С. Бреннер, 1963). Значительный успех молекулярной биологии - первый химический синтез гена, который осуществил в 1968 X. Корана. Данные о химической природе и тонком строении генов способствовали разработке методов их выделения (впервые осуществлено в 1969 Дж. Беквитом).

Исследование  механизма биосинтеза белка позволило  установить так называемый центральный  постулат, характеризующий движение генетической информации: ДНК--> матричная рибонуклеиновая кислота (м РНК) --> белок (существование м РНК впервые предсказано Белозерским и А. С. Спириным в 1957). Согласно этому постулату, белок представляет собой своего рода информационный клапан, препятствующий возвращению информации на уровень РНК и ДНК.

Образование в организме белков и нуклеиновых  кислот осуществляется по типу матричного синтеза, для которого необходима матрица, или "шаблон",- исходная полимерная молекула, которая предопределяет последовательность нуклеотидов (аминокислот) в синтезируемой  копии (гипотеза о таком механизме  синтеза биополимеров сформулирована в 1928 Н. К. Кольцовым). Такими матрицами  являются ДНК при репликации и  транскрипции (синтез м РНК на матрице ДНК), а также м РНК при трансляции (синтезе белка на матрице м РНК). Важное значение имело открытие обратной транскрипции, т.е. синтеза ДНК на матрице РНК, которое происходит у онкогенных РНК-содержащих вирусов с помощью специального фермента - обратной транскриптазы (X.Темин и Д.Балтимор, 1970). Открытие генетического кода (его концепция сформулирована А. Даунсом и Г. Гамовым в 1952 - 1954, а расшифровка осуществлена М. Ниренбергом,

X. Маттеи, С. Очоа и Кораной в 1961-65) позволило установить соотношение последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах с последовательностью аминокислот в белках. Регуляция синтеза белка наиболее изучена на уровне транскрипции. Для объяснения механизма регуляции важное значение имеет концепция оперона (совокупность связанных между собой генов и прилегающих к ним регуляторных участков), разработанная Жакобом и Ж. Моно в 1959, открытие белков-репрессоров (подавляют транскрипцию гена; см. Регуляторные белки), регуляции по принципу обратной связи (см. также Регуляторы ферментов). К сер. 60-х гг. 20 в. утвердилось представление об универсальности основных черт строения и функции гена как сложной линейной структуры ДНК, который в результате транскрипции и послед. трансляции определяет первичную структуру полипептидной цепи.

Молекулярная  биология рассматривает также ряд  других вопросов фундаментального и  прикладного характера. Большой  интерес и значение имеют исследования репараций (исправлений) повреждений  генома, причиненных коротковолновой  радиацией, мутагенами и др. Большую  самостоятельную область составляют исследования механизма действия ферментов, основанные на представлениях о трехмерной структуре белков и роли слабых взаимодействий. Выяснены многие детали строения и  развития вирусов, в особенности  бактериофагов (вирусов бактерий). Изучение гемоглобинов у лиц, страдающих серповидно-клеточной  анемией и другими гемоглобинопатиями, положило начало изучению структурной основы "молекулярных болезней" - врожденных ошибок метаболизма.

Важная  область молекулярной биологии - генетическая инженерия, разрабатывающая методы конструирования наследственных структур в виде молекул рекомбинантных ДНК. Применение методов генетической инженерии позволило в короткие сроки выделить многочисленные гены и установить в них последовательность нуклеотидов. Таким образом, были обнаружены мигрирующие генетические элементы (впервые предсказаны Б. Мак-Клинток в конце 40-х гг. 20 в.), установлена молекулярная природа вариабельности молекул антител, открыта прерывистость в структуре эукариотических генов и установлены новые принципы регуляции их активности. На базе генетической инженерии стала активно развиваться биотехнология, связанная с производством пептидов и белков, таких, как человеческие гормон роста, инсулин, интерфероны и др. Целенаправленное изменение структуры генов и их регуляторных областей и введение таких генов в бактериальные, животные и растительные клетки позволило создавать трансгенные организмы, способные вырабатывать новые белки (белковая инженерия) и придавать новые свойства этим организмам.

Для проведения исследований в молекулярной биологии широко используют физико-химические методы и биологические эксперименты. Применяют различные виды хроматографии, ультрацентрифугирование, рентгеноструктурный анализ, электронную микроскопию, ЭПР, ЯМР и изотопные индикаторы, используют также синхротронное (магнитно-тормозное) излучение, дифракцию нейтронов и лазерную технику. В экспериментах широко применяют модельные системы "ин витро" и мутагены.

Важное  практическое значение молекулярная биология играет в развитии сельского хозяйства (направленное и контролируемое изменение  наследств аппарата животных и растений для получения высокопродуктивных пород и сортов), микробиологические примеси (см., напр., Микробиологический синтез), в развитии теоретических основ различных разделов медицины. Актуальные проблемы молекулярной биологии - исследование молекулярных механизмов злокачественного роста клеток, поиск способов предупреждения наследств. заболеваний, познание механизмов памяти, дальнейшее изучение механизмов действия ферментов, гормонов.

  Электрофорез (electrophoresis) - направленное перемещение заряженных частиц в дисперсионной среде под действием внешнего электрического поля. Электрофорез широко используется для разделения биологических макромолекул – белков, нуклеиновых кислот, антигенов и антител (иммуноэлектрофорез), мелких хромосом (получение электрокариотипов) и др. При использовании определенных сред (гелей) подвижность различных макромолекул становится функцией не только их заряда, но и их молекулярной массы. Электрофорез был предложен Ф.Ф. Рейссом в 1807, а в биологии его использование было начато в 1930-е гг. ХХ в. А.Тизелиусом, сконструировавшим первый прибор для электрофоретического разделения белков.

История открытия электрофореза

          Рейсс Федор Федорович (Фердинанд Фридрих) (06.02.1778– 02.04.1852) химик и врач, член-корреспондент Петербургской АН (с 1805 г.), приглашен в Россию на должность профессора химии Московского университета (с 1804 г.). Одновременно занимал кафедру химии и фармакографии Московского отделения Медико-хирургической академии (1817–1839). Первые электрокинетические явления — электрофорез и электроосмос были открыты профессором Московского университета Ф.Ф. Рейссом в 1807 г.; его статья « Notice sur un nouvel effet de l'électricité galvanique » опубликована в 1809 г.

        Помимо  изучения явлений электроосмоса и электрофореза провел анализ кавказских и тверских минеральных вод, действующих начал хинной коры, изучил лечебное действие лекарств. На протяжении многих лет исполнял обязанности библиотекаря Московского университета и председателя Физико-медицинского общества при университете. Много внимания уделял восстановлению университета после пожара 1812 г. В 1839 г. вернулся в Германию.

         В 1935 г. А. Тизелиус (шведский биохимик)  начал детальное исследование электрофореза, в результате которого создал усовершенствованный метод электрофоретического анализа с различными модификациями: микроэлектрофорез, электрофорез на бумаге, иммуноэлектрофорез. Результаты этих исследований были опубликованы в "Трудах Фарадеевского общества" в 1937 г. Для изучения электрофореза Тизелиус сконструировал специальный электрофоретический прибор, состоящий из стеклянной U-трубки с коллоидным раствором и двух электродов, выведенных из трубки в отдельные сосуды.

        В  последующие годы А. Тизелиус и его сотрудники работали над применением электрофоретического метода к решению прикладных задач биохимии. В 1938 г. в Институте физической химии, которым руководил Т. Сведберг, благодаря личным денежным средствам ректора Упсальского университета Г. Якобссона и его супруги специально для Тизелиуса была создана новая кафедра химии и физики жизни. В 1946 г. в университете открылся биохимический факультет, а в 1950-1952 гг.- новый Институт биохимии. Под руководством Тизелиуса ученые этого Института внесли огромный вклад в развитие новых биохимических методов: электрофореза, хроматографии, фазового разделения, гель-фильтрации и т. п.

        Различные  модификации электрофоретического  анализа нашли самое широкое  применение при исследовании  и разделении нормальной и  патологической сывороток, чистых  белков и их смесей, ферментов,  нуклеопротеидов, детергентов, нуклеиновых  и аминокислот, стеринов, жирных  кислот и других биохимически важных соединений. С помощью иммуно-электрофореза Тизелиус заложил основы изучения белковой структуры нормальной сыворотки крови, выделив из нее три различных белка (сейчас их обнаружено более 20).

        В  1948 г. за исследования электрофореза  и адсорбционного анализа, особенно  за открытия, связанные с комплексной  природой белков сыворотки, А.  Тизелиусу была вручена Нобелевская премия по химии.

Принцип метода электрофореза

        Находящиеся  в буферном растворе макромолекулы  обладают некоторым суммарным  электрическим зарядом, величина  и знак которого зависят от  рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например, стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают

разные скорости. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных  молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с

одной и той же скоростью. И в этом — сущность процесса электрофореза. Со временем эти зоны распределяются по длине канала (рис. 1).

    На рисунке,  помимо рабочего канала (трубки), показаны некоторые необходимые  компоненты системы. Во-первых, это  два электрода, представленные  спиральками из платиновой проволоки,  а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся в них буферные  растворы и рабочий канал замыкается  электрическая цепь между электродами. 

Рис. 1. Схема простейшего  прибора для электрофореза в  геле

а — до начала фракционирования, б —

после его окончания

       Такие  приборы использовались на первых  этапах развития метода (электрофорез  в свободной жидкости). В жидкости  нельзя избежать конвекции, которая  деформирует и смешивает разделяющиеся  зоны. Поэтому в современных приборах  рабочий канал заполняют гелем,  что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо  смачиваемая (гидрофильная) пространственная  сетка геля удерживает жидкость  от вытекания и препятствует  конвекции. Вместе с тем используемые  гели содержат очень много  жидкости (80—99,5%), в которой (т.  е. в рабочем буфере) и мигрируют  макро молекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул.