Мікози. Санітарна мікробіологія

Загальне мікробне число (загальна мікробна забрудненість) об'єкта характеризується кількістю мікроорганізмів в 1 мл води, іншої рідини чи в 1 г твердої  речовини.

Визначення мікробного числа є  непрямим методом і дозволяє зробити  висновок про можливе зараження  досліджувано тварин. Кількість їх збільшується по мірі забруднення навколишнього  середовища і зменшується при  його самоочищенні. Таким чином, бактеріальна забрудненість субстрату, яка визначається цим методом, виявляється значно меншою, ніж за прямим підрахунком (не дають росту мертві клітини та живі, що втратили здатність розмножуватись; не ростуть термофіли та психрофіли, анаероби, гриби; не завжди розбиваються конгломерати, і одна колонія виростає із декількох клітин). .Кількість  мікроорганізмів, які виростають на МПА виявляється в багато разів  меншою, ніж їхній справжній вміст  у досліджуваному об'єкті.

Сапрофітні мікроорганізми - головні  збудники псування харчових продуктів, тому при оцінці якості цих продуктів  визначають мікробне число.

При незначному мікробному забрудненні  об'єкта робиться висів цільного матеріалу. При масивному забрудненні необхідно  робити розведення, з яких потім  здійснювати висів на середовища.

Для приготування розведень беруть ряд пробірок, у кожній з яких міститься 9 мл стерильної води чи фізіологічного розчину. До першої пробірки вносять 1 мл досліджуваного матеріалу, ретельно перемішують новою піпеткою шляхом багаторазового наповнювання піпетки  і переносять 1 мл до другої пробірки (розведення 10~2)

Існує кілька методів визначення загального мікробного числа: метод прямого  підрахунку і метод кількісного  посіву різних розведень зразків  і проб досліджуваного об'єкта.

Прямий підрахунок мікроорганізмів  у досліджуваному об'єкті проводиться  під мікроскопом у рахувальних  камерах Горяєва чи в камерах, спеціально сконструйованих для  підрахунку бактерій. За допомогою  цього методу визначають загальну кількість  живих та мертвих клітин. Завчасно, досліджувану пробу обробляють так, щоб одержати гомогенну суспензію. Для полегшення підрахунку бактерій додають барвник, частіше за все  еритрозин. Можна здійснювати прямий підрахунок і на мембранних фільтрах, через які пропускають речовину чи суспензію. Застосовується він у  надзвичайних випадках, коли потрібна негайна відповідь відносно кількісного  вмісту бактерій, наприклад, при аваріях  систем водопостачання, оцінці ефективності роботи очисних споруд тощо. Метод  простий і доступний для використання в санітарно-бактеріологічних лабораторіях, проте має ряд недоліків. За його допомогою важко відрізнити мікроорганізми від сторонніх часток, точно визначити  кількість мікроорганізмів, оскільки вони часто утворюють великі скупчення (конгломерати), неможливо диференціювати живі мікроорганізми та мертві, санітарне  значення яких неоднакове, важко підрахувати  дрібні мікроорганізми.

Метод кількісного посіву досліджуваного матеріалу на щільні поживні середовища дозволяє підраховувати живі мікроорганізми. При визначенні мікробного числа  виявляють, в основному, колонії  мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних бактерій, здатних розмножуватися на МПА, тобто використовувати білок  і продукти його розщеплення як джерело  азотного живлення. Ці мікроорганізми є основними споживачами органічних речовин, які вносяться до грунту та води з різними відходами промислових  підприємств, виділеннями людей.

Посів за методом Коха використовується для визначення загальної кількості  бактерій. У порожню стерильну  чашку Петрі наливають 1 мл досліджуваного матеріалу з відповідного розведення і заливають 10-15 мл розплавленого, охолодженого до 45° С МПА, змішують з рідиною, обертаючи чашку на поверхні стола. Після застигання агару чашку  перевертають кришкою вниз, культивують  при 37° С протягом 24-48 годин чи при 22° - 72 години.

Колонії підраховують як на поверхні, так і в товщі агару, для  чого чашку кладуть догори дном на чорний фон. Кожну колонію відмічають чорнилами. Оцінюють тільки ті чашки, на яких виросло від ЗО до 300 колоній. Якщо на чашці з найбільшим розведенням  виросло понад 300 колоній і аналіз не можна повторити, то допускається підрахування колоній при сильному боковому освітленні за допомогою спеціальної  пластинки з сіткою та лупи. Підраховується кількість не менше ніж у 20 квадратах  площею 1 см2 у різних місцях чашки. Розраховується середня кількість колоній у 1 см2, яку помножують на площу чашки.

У результаті підрахунку колоній у  кожній чашці визначають кількість  бактерій на 1 мл (1 г) досліджуваного матеріалу  з урахуванням розведення. За кількість  бактерій приймають середнє арифметичне  результатів підрахунку колоній  на чашках з посівом двох сусідніх розведень.

Наприклад: розведення 101—310 колоній, розведення 10~2-35 колоній.

Загальна кількість бактерій - 310*10+35x100

Результат дослідження можна округлити  до 2-3 значущих цифр (наприклад, 7989 до 8000).

Титраційний метод використовується для визначення кількості санітарно-показових  мікроорганізмів. Суть його полягає  в наступному:

- досліджуваний матеріал гомогенізують,  при дослідженні твердих речовин  готують суспензію;

- готують серії розведень;

- роблять посів визначених об'ємів  і їхніх розведень (по 1 мл) до  рідкого поживного середовища. Кожен  об'єм потрібно засівати в декілька  пробірок (2-х, 3-х, 4-х, 5-ти і т. д.  рядні посіви). Оптимальним є 3-х  рядний посів (трикратне повторення);

- відмічають наявність росту  на рідкому поживному середовищі  та висівають із пробірок, в  яких відмічено ріст, на щільне  поживне середовище;

- проводять ідентифікацію мікроорганізмів,  які виросли на щільному середовищі. Враховуються морфологічні, тинкторіальні,  культуральні, фізіолого-біохімічні  властивості.

Якщо застосовувався однорядний метод, результат виражається у вигляді  титру - найменшого об'єму, в якому  знайдено досліджуваний організм (найбільше  розведення) .

Якщо застосовувався багаторядний метод, результати підраховують за допомогою  спеціальних таблиць, котрі дозволяють за комбінацією позитивних об'ємів визначити титр та індекс.

Метод мембранних фільтрів використовується для визначення кількості санітарно-показових  мікроорганізмів у матеріалах, що містять мало дисперсної фази.

Для його застосування необхідне спеціальне обладнання, фільтри та фільтраційні установки. Для санітарно-бактеріологічних досліджень використовуються фільтри, непроникні для бактерій. Фільтраційна установка складається із фільтраційного апарата (наприклад, фільтра Зейтца) та джерела вакууму. Для стерилізації фільтри занурюють у воду, нагріту  до 80° С, потім нітроцелюлозні фільтри  тричі кип'ятять по 10 хв, замінюючи  воду, а мембранні - «Владипор» - 1 раз  протягом 10-15 хв.

Фільтраційний апарат стерилізують за допомогою змоченого у спирті ватного тампона. Стерильний мембранний фільтр стерильним пінцетом кладуть  на сітку фільтраційного апарата  та закріплюють відповідно до інструкції приладу. До стакана фільтраційного приладу наливають необхідний об'єм досліджуваного матеріалу чи його розведення. При фільтруванні невеликих об'ємів рідини (1 мл) у стакан спочатку наливають 10 мл стерильної води. Загальний об'єм рідини, яку фільтрують, не повинен перевищувати і 100 мл. Для великих об'ємів беруть декілька фільтрів. Створюють вакуум у приймальній ємності. Після закінчення фільтрації витримують деякий час для видалення надлишку вологи. При збереженні вакууму апарат розбирають і стерильним пінцетом, не перевертаючи, переносять фільтр на поверхню щільного поживного середовища, не допускаючи утворення бульбашок повітря між фільтром і середовищем.

При наявності в рідині великої  кількості завислих часток на поверхні робочого фільтра розміщують планктонний  фільтр. У цьому випадку на поживне  середовище переносять обидва фільтри, інкубують посіви 24 год при 37°  С. Після цього підраховують колонії, типові для визначаємого мікроорганізму. Об'єм рідини для фільтровання підбирається таким чином, щоб на фільтрі виростало  не більше ЗО колоній. З фільтра вибирається  декілька типових колоній для  проведення ідентифікації за допомогою  визначення морфологічних, тинкторіальних, культуральних та фізіолого-біохімічних  ознак.

Результати виражають у вигляді  індекса за формулою

 

 

де N - кількість колоній, V - профільтрований  об'єм води в мілілітрах.

 

2.2 Санітарно-показові мікроорганізми

Основними джерелами розповсюдження патогенних мікроорганізмів у навколишньому  середовищі є люди та теплокровні  тварини (хворі, бактеріо- та вірусоносії). Виділення мікроорганізмів до оточуючого середовища відбувається переважно  фекальним та повітряно-крапельним шляхами.

Безпосередньо виявити патогенні  мікроорганізми в об'єктах зовнішнього  середовища надзвичайно важко. Пов'язано  це з їхньою низькою концентрацією, коливанням вмісту (наявністю під  час епідемії та відсутністю в  міжепідемічний період

Бактерії групи кишкових паличок

Під загальною назвою «Бактерії  групи кишкових паличок» (БГКП) об'єднують  бактерії родини Enterobacteriaceae, рр. Escherichia, Citrobacter, Enterobacter і Klebsiella (за Біргером). До бактерій групи кишкових паличок  відносяться грамнегативні неспороутворюючі палички, які зброджують лактозу  з утворенням кислоти і газу при 37° С протягом 1-2 діб чи зброджують глюкозу з утвореннями кислоти  та газу протягом 1 доби, в яких відсутня оксидазна активніствІПозитивна відповідь  про наявність у досліджуваному об'єкті БПСП дається на основі визначення грамнегативних паличок і негативного  оксидазного тесту.

У відповідності до ДСТУ 18963-73 ігри характеристиці БГКП ураховують наступні диференційно-діагностичні ознаки:

- інкубація посівів при 37°  С;

- характер росту на середовищі  Ендо - лактозний тест (враховуються  темно-червоні колонії з металевим  блиском (Е. coli) чи без нього  (Enterobacter aerogenes);

- забарвлення за Грамом;

- бродильна проба на середовищі  з глюкозою.

Мірністю розповсюдження в навколишньому  середовищі, складністю чи неможливістю культивування на штучних середовищах, тощо. Виявленню патогенів заважають  і сапрофітні мікроорганізми, вміст  яких у дослідних об'єктах значно більший. Тому можливе забруднення  патогенними мікроорганізмами визначають базуючись на непрямому показникові - виявленні санітарно-показових мікроорганізмів, які є постійними мешканцями організму людини та тварин (кишечнику, верхнього відділу дихальних шляхів, поверхні ті»а). Вони складають нормальну мікрофлору і тільки при певних умовах можуть проявляти патогенні властивості.

Виявлення таких мікроорганізмів  у об'єктах зовнішнього середовища свідчить про їхнє забруднення виділеннями  людини та тварин. Чим більше таке забруднення, тим більша вірогідність потрапляння  до об'єкта патогенних мікроорганізмів.

Санітарно-показові мікроорганізми повинні  відповідати певним вимогам:

- постійно мешкати в організмі  людини та тварин і у великій  кількості виділятися в навколишнє  середовище;

- зберігати життєздатність у  зовнішньому середовищі протягом  термінів, близьких до виживання  патогенних мікроорганізмів, які  виділяються тими ж шляхами;

- не повинні розмножуватися  в довкіллі;

- повинні легко виділятися з  об'єктів і не пригнічуватися  сапрофітами;

- не повинні змінювати своїх  біологічних властивостей;

- не повинні мати іншого природного  резервуара, крім організму людини  та тварин;

- повинні бути більш стійкими  до дії фізичних та хімічних  факторів зовнішнього середовища, ніж патогенні мікроорганізми;

- індикація, ідентифікація та  кількісний облік повинні здійснюватися  сучасними, простими, легко доступними  та економічними мікробіологічними  методами.

Усі бактерії, які дають ріст на середовищі Ендо при 37° С протягом 24 год. називаються ендобактеріями. Серед них переважають грамнегативні  мікроорганізми, проте іноді зустрічаються  і грампозитивні палички, і коки. Загальну кількість цих бактерій враховують при санітарно-гігієнїчній  оцінці водоочисних споруд та характеристиці процесів самоочищення водойм.

До них відносять грамнегативні, неспороутворюючі, окси-дазонегативні  бактерії із ентеробактерій виділяють  БГКП -бактерії, які зброджують глюкозу  до кислоти і газу при температурі 37° Ожеред БГКП виділяють лактозопозитивні палички (Л КП), які ферментують  лактозу до кислоти і газу при 37е С. із ЛКП виділяють фекальні кишкові палички (ФКП), які зберігають здатність розщеплювати лактозу  при 44,5Ц С. Наявність ФКП є показником свіжого фекального забруднення  із ФКП до Еcoli відносять тільки бактерії, які не здатні рости на нитратному середовищі.

 

Таблиця 1. Санітарно-показові мікроорганізми, які визначаються в різних об'єктах  зовнішнього середовища (за Т.Н. Чистовичем)

Досліджуваний об'єкт	Caнiтapнo-пoкaзoвi мікроорганізми
Вода	БГKП, ентерококи, стафілококи
Грунт	БГKП, ентерококи, анаероби Clostridium perfringens, термофіли
Повітря	Стрептококи, стафілококи
Харчові продукти	БГKП, ентерококи, стафілококи, бактерії групи протея
Предмети загального вжитку	БГKП, стафілококи, ентерококи

 

Санітарно-показові мікроорганізми, які визначаються при дослідженні  різних об'єктів зовнішнього середовища, наведені в таблиці 1.