Микрофлора почвы

1 - отсутствие                      - 0  - 20%  токсичных образцов

2 - слабо выраженная                - 21 - 40%    

3 - средняя                         - 41 - 60%     

4 - сильно выраженная               - 61 - 80%     

5 - абсолютная                      - 81 - 100%    

Для определения токсичности почв можно использовать два метода - качественный и качественно-количественный.

Качественный метод определения  токсичности почв. В стерильную чашку  Петри вносится 10 г перемешанной и просеянной почвы и ровным слоем  распределяется на половину дна чашки. На дне и крышке чашки записывается номер пробы по журналу и тест-микроорганизм. Затем чашки переносятся в  бокс и устанавливаются на ровной поверхности. Чашки с почвой заливают 1,5% непитательным агаром в количестве около 10 мл с таким расчетом, чтобы он покрыл слой почвы. После его застывания в чашки вносится питательный агар также в количестве 10 мл, адекватный тест-микроорганизмам. С одного почвенного образца готовятся 2 параллельные чашки к каждому микроорганизму. Чашки высушивают под бактерицидными лампами в течение 30 минут. Затем производится посев индикаторных штаммов микроорганизмов.

Посевы производятся петлей, причем движения петли всегда начинают с  той части чашки, на которой помещена почва. В качестве контроля производят посевы тех же культур на аналогичные  среды, но без почвы.

Посевы инкубируют в зависимости  от вида индикаторного микроорганизма. Учет результатов начинается с просмотра  контрольного посева. В случае равномерного роста тест-микроба на всей поверхности  агаровой пластинки просматривают  остальные чашки с посевами. Колонии  идентифицируются по "форме роста". Кроме того, из каждой серии посевов  с нескольких чашек снимают колонии  и производят их идентификацию.

Распределение выросших колоний на всей поверхности среды свидетельствует  о том, что исследуемая почва  нетоксична (Н/Т), а в случае роста  колоний только на участке агаровой пластинки, под которой нет почвы, показывает, что исследованный почвенный  образец токсичен (Т). При исследовании некоторых почвенных проб отмечается частичное ингибирование роста  тест-микроба. В этих случаях регистрируется маловыраженная токсичность (М/Т).

Качественно-количественный метод  определения токсичности почв. В  стерильную чашку Петри также  вносится 10 г почвы, но распределяется равномерно по всей поверхности, затем, как и при качественном методе, вносится непитательный и питательный  агар. В качестве дополнительного барьера между почвой и индикаторным штаммом на поверхности питательной среды укладывают мембранный фильтр.

На матовую поверхность мембранных фильтров N 3 - 4 простым карандашом наносятся 16 точек, после чего фильтр стерилизуется  кипячением обычным способом. Затем  на поверхность питательной среды  помещаются мембранные фильтры (матовая  поверхность - вверх) в количестве от 1 до 4-х на одну чашку. На поверхность  фильтра в местах, отмеченных точками, производится посев бактериальной  петлей (иглой) культуры индикаторного  штамма, суспензированного в физиологическом растворе, содержащем около 100 млн. бактериальных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности. Эта манипуляция упрощается при использовании специального штампа в виде металлического диска диаметром около 30 мм. В диск вмонтированы 16 стальных игл строго одинаковой длины и толщины. Культуры микроорганизмов наливаются в чашки Петри и погружают в них кончики игл стерильного штампа, а затем одновременно производится посев в 16 точках мембранного фильтра. Посевы инкубируются в термостате или анаэростате при оптимальной температуре и продолжительности в зависимости от физиологических особенностей каждого вида.

Учет результатов производится путем подсчета выросших колоний  от количества точек посев. Процент  пророста (Р) высчитывается как количество образовавшихся колоний к количеству посевов. Токсичность определяется по формуле: Т = 100 - Р. Этим методом, как и качественным, устанавливается абсолютная токсичность, когда на фильтрах не вырастает ни одной колонии; отсутствие токсичности - на местах всех посевов вырастают колонии и различная степень токсичности - когда прорастает только часть засеянных точек.[21]

4.7 Определение сальмонелл в почве.

С целью определения сальмонелл в почве могут быть использованы два равнозначных по эффективности  метода.

1. Усовершенствованный метод коагуляции  с центрифугированием по Фиккеру (увеличение скорости центрифугирования с 3000 об./мин. до 5000 об./мин. повысило чувствительность метода в 5,8 раза).

2. Метод обнаружения сальмонелл  в почве с использованием магниевой  среды накопления, исключающей необходимость  дополнительной обработки почвенной  суспензии (коагуляцию с центрифугированием).

 Выделение   сальмонелл   из   почвы   методом   коагуляции   с центрифугированием. Для  концентрирования  сальмонелл  применяется 10% раствор сернокислого железа (Fe (SO ) ).  В исследуемый объем 2   4 3почвенной   суспензии   (500  мл)  добавляют 2  мл  10%  раствора углекислого  натрия (Na CO ) для подщелачивания,  что способствует 2  3 процессу  коагуляции,  и 1,7 мл 10% раствора Fe (SO ) .  Суспензии  2   4 3

тщательно  перемешивают  с  коагулянтами  и  помещают  на  1 час в холодильник при температуре +4° до полного образования хлопьев.

Через час осадок вместе с надосадочной жидкостью разливают в стерильные центрифужные стаканы по 100 мл и центрифугируют 5 минут со скоростью 5000 об./мин. Если позволяет техническая возможность лаборатории, лучше проводить центрифугирование 500 мл почвенной суспензии без ее предварительного дробления. Жидкость над осадком, образовавшимся после центрифугирования, выливают и добавляют по 1,0 мл 25% раствора виннокислого калия, тщательно перемешивают и содержимое всех центрифужных стаканов сливают в одну колбу для дальнейшего исследования.

По 0,1 - 0,5 мл образовавшейся взвеси пипеткой засевают на 3 - 5 чашек с висмут-сульфитным агаром и шпателем растирают по поверхности агара. К оставшейся взвеси добавляют 50 мл желчного бульона с концентрацией желчи 10 - 20%. Посевы инкубируются при температуре 37 °C.

Из сред накопления делают высев  петлей на 3 - 5 чашек висмут-сульфитного  агара через 5 часов инкубации, второй - через 20 часов. При этом основным является посев через 5 часов, а через 20 часов - дополнительным (в случае отсутствия срочности результатов исследования можно ограничиться лишь высевом через 20 часов инкубации желчного бульона).

Дальнейшая идентификация сальмонелл проводится по общепринятой методике.

Применение магниевой среды "М" для обнаружения сальмонелл в  почве. Этот метод более простой, не требует каких-либо дефицитных реактивов  и специального оборудования. Применение магниевой среды "М" сокращает  время обработки каждой пробы  почвы на 1,5 часа. Однако следует  учитывать, что среда "М" угнетает рост сальмонелл тифа.

В данном случае среда "М" используется в экспедиционной модификации Г.Г. Калины.

В почвенную суспензию вносят растворы и навески ингредиентов среды "М" с расчетом на исследуемый объем  суспензии.

Посевы инкубируются в термостате при температуре 37°. Через 18 - 20 часов  производят высев петлей на 3 - 5 чашек  висмут-сульфитного агара. Дальнейшая идентификация проводится по общепринятой методике.

При исследовании сильнозагрязненных почв возможна замена желчного бульона  и среды "М" широко распространенным в настоящее время селенитовым  бульоном в классической прописи  в первом случае и двойной концентрации - во втором (соотношение почвенной  суспензии и среды 1:1). Однако необходимо отметить, что чувствительность метода коагуляции с центрифугированием при  этом снижается на один, а без  обработки коагулянтами - на два  порядка, к тому же при использовании  селенитового бульона высев через 5 часов инкубации малорезультативен.

4.8 Обнаружение сибироязвенной палочки в почве.

Исследования по выделению  Bac. anthracis из почвы производится в лабораториях, имеющих условия и разрешение на работу с возбудителями особо опасных инфекций.

Предварительная подготовка проб почвы. Навеску почвы в 5 - 30 г  взбалтывают в течение 10 минут  с 50 - 100 мл стерильной воды, а затем  отстаивают. Для уничтожения вегетативных форм микроорганизмов к почвенной  взвеси добавляют в избытке кристаллов мочевины и подогревают на водяной  бане при температуре 37° в течение 5 - 10 минут. Надосадочную жидкость сливают, доводят по объему до 1-го литра стерильным физиологическим раствором; 0,5 л равными порциями фильтруют через 4 мембранных фильтра без прогревания, а вторые 0,5 л в колбах предварительно прогревают при температуре 65 - 70° в течение 30 минут или при температуре 80° в течение 10 минут и также фильтруют через 4 мембранных фильтра.

Для проведения люминесцентно-серологического  анализа 2 фильтра засевают на чашки  с 0,7% МПА путем накладывания мембранного  фильтра на питательную среду вверх поверхностью, через которую фильтровали почвенную взвесь, а с остальных фильтров делают смыв в стерильных чашках Петри, для чего на поверхность наносят 1 мл физиологического раствора. Смыв используют для посева на среду ГКИ, введения белым мышам (тест капсулообразования in vivo) и исследования люминесцентно-серологическим методом.

Аналогично исследуются  и фильтры, через которые профильтровывали прогретую надосадочную жидкость.

Предварительный положительный  ответ (сигнальный) дается на основании  специфического свечения материала  в люминесцентно-серологическом анализе, капсулообразования in vivo и in vitro.

Люминесцентно-серологический анализ. Из исследуемых суспензий, полученных с мембранных фильтров, делают мазки  на предметных стеклах, фиксируют путем  погружения на 10 - 15 минут в метанол  и окрашивают продажной люминесцирующей  адсорбированной сибиреязвенной сывороткой в рабочем разведении, указанном  в наставлении и на этикетке ампулы. Для этого на препарат наносят  каплю сыворотки и помещают на 20 мин. во влажную камеру, затем промывают  забуференным физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,4) в течение 10 минут и докрашивают люминесцирующей сывороткой против глобулинов кролика в рабочем разведении, смешанной с бычьим альбумином, меченным родамином в течение 15 минут. Мазки вновь промывают забуференным физиологическим раствором, подсушивают, наносят каплю смеси 9 частей глицерина и одной части забуференного раствора и закрывают покровным стеклом. В препаратах, содержащих микробные клетки с капсулой, наблюдается их ярко-зеленое свечение.

Капсулообразование. Капсулообразование устанавливают "прямым" путем в результате бактериоскопии окрашенных (методами выявления капсул) мазков, приготовленных из фильтратов, а также мазков, приготовленных из посевов на питательные среды: Государственного института им. Тарасевича, среду Томова или Буза.

Из различных способов окраски капсул наиболее простым  и демонстративным является применение раствора Ребигера, который одновременно фиксирует и красит мазки. Берут 15 - 20 г генциана фиолетового и растворяют в 100 мл 40% формалина. Раствор выдерживают при комнатной температуре несколько часов, затем фильтруют. Нефиксированный мазок покрывают краской на 15 - 20 секунд, после чего промывают водой и высушивают. Капсулы окрашивают в красно-фиолетовый цвет, а тело бациллы - в темно-фиолетовый.

Тест на капсулообразование in vivo по Шляхову и Груз проводится следующим образом. Исходный смыв с фильтров вводят по 0,5 мл внутрибрюшинно 6 - 8 белым мышам. После инокуляции материала животным одну пару мышей оставляют под наблюдением 10 суток, как при классической биологической пробе. Остальных мышей забивают (по 2 мыши) через 1, 2 и 3 часа. Забитых мышей вскрывают. Из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки; из селезенки, почек, легких, печени делают мазки-отпечатки, окрашивают по Ребигеру или леффлеровской синькой и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек сибирской язвы.

Окончательное заключение дается на основании выделения чистых культур  и их изучения.

Посев и идентификация  чистых культур. Посев исходного  материала производят на МПА или  МПБ, приготовленные на переваре Хоттингера (амминного азота 100 - 110 мг%, pH среды 7,2 - 7,6). Посевы инкубируют при температуре 37° в течение 18 - 24 часов. На агаре сибиреязвенная палочка растет в виде серовато-белого сухого налета, по краям которого при малом увеличении видны локообразные завитки. В бульоне наблюдается рост на дне пробирки в виде комка ваты, бульон остается прозрачным.

На МПБ и МПА Bac. anthracis в обычных аэробных условиях растет в виде бескапсульных особей, что не позволяет определить один из важнейших признаков - капсулообразование. Для выявления последнего наилучшим, "прямым" способом является заражение животных (белых мышей) с последующим исследованием патологоанатомического материала.

Существуют также другие лабораторные приемы выявления капсулообразования наряду с прочими признаками сибиреязвенного микроба. В частности, для этих целей предложен ряд элективных питательных сред: среда ГКИ, Томова, Буза.

Посевы на средах Томова и Буза инкубируют в атмосфере 20 - 40% углекислого газа (в кристаллизаторе или микроанаэростате) в течение 18 - 24 часов, затем делают мазки, окрашивают и микроскопируют на предмет выявления капсульных палочек антракса. На средах Томова и Буза колонии сибиреязвенной палочки растут в S- или SM-форме: гладкие, блестящие, слизистой консистенции.