Микрофлора почвы

Таблица 2

СХЕМА ОЦЕНКИ САНИТАРНОГО СОСТОЯНИЯ  ПОЧВЫ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

-------------+-------------------------------------+--------------

¦ Категория  ¦                Титры                ¦ Количество  ¦

¦    почв    +----------+-------------+------------+термофильных ¦

¦            ¦ Кишечной ¦Нитрифицирую-¦Cl. perfrin-¦ бактерий в ¦

¦            ¦ палочки ¦щих бактерий ¦gens        ¦грамме почвы ¦

+------------+----------+-------------+------------+-------------+

¦Чистая      ¦1,0 и выше¦0,1 и выше   ¦0,01 и выше ¦100 - 1000   ¦

¦            ¦          ¦             ¦            ¦             ¦

¦Загрязненная¦0,9 - 0,01¦0,09 - 0,001 ¦0,009 -     ¦1001 - 100000¦

¦            ¦          ¦             ¦0,0001      ¦             ¦

¦            ¦          ¦             ¦            ¦             ¦

¦Сильно за-  ¦0,009 и   ¦0,0009 и ниже¦0,00009 и   ¦100001 -     ¦

¦грязненная  ¦ниже      ¦             ¦ниже        ¦4000000      ¦

-------------+----------+-------------+------------+--------------

 

Наличие кишечной палочки в титрах 0,9 и ниже свидетельствует о несомненном  фекальном загрязнении почвы, притом свежем. Одновременно могут быть зарегистрированы низкие титры Cl. perfringens и нитрификаторов. Однако следует иметь в виду, что в первое время после имевшего место органического загрязнения нитрификаторов может быть мало - необходимо время, чтобы они успели размножиться.[15]

В процессе самоочищения на разных этапах возникают различные количественные соотношения этих показателей. Наиболее быстро отмирает кишечная палочка, поэтому  при сравнительно высоких ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения.

Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки  при низких титрах остальных 3-х показателей  характеризует почву как свободную  от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились  процессы распада и минерализации  органических веществ.

Высокие титры всех показателей  свидетельствуют о законченных  процессах самоочищения и характеризуют  почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерий и органических загрязнений.

Эти моменты имеют важное значение при определении не только фактического санитарного состояния почвы определенных территорий, но и для выяснения стадий течения процесса самоочищения, установления сроков полива, удобрения почвы навозом и т.д.

О загрязнении почвы навозом  и компостами свидетельствует повышенное содержание в ней термофилов (более 1000 клеток в 1 г почвы).

Дополнительным показателем является общее количество бактерий в грамме почвы. Единого норматива этого  показателя нет, так как количество бактерий в почвах разных типов и  климатических районов сильно варьирует. Для подзолистых почв наличие 10 млн. бактерий в грамме почвы и более  указывает на фекальное загрязнение. Для других типов почв необходимо устанавливать конкретные нормативы  этого показателя.[16]

Приведенная выше схема позволяет  оценивать санитарное состояние  почвы в 2-х аспектах: загрязнения  патогенными энтеробактериями и органическими веществами. Причем исследования, проведенные в ИОКГ им. А.Н. Сысина, Молдавском НИИ гигиены и эпидемиологии и в Киевском НИИ ОКГ им. А.Н. Марзеева, показали, что основной косвенный показатель - численность кишечных палочек - является надежным индикатором фекального загрязнения почвы и при загрязнении ее химическими веществами. Вышеизложенное позволяет рекомендовать эту схему для оценки санитарного состояния почвы независимо от того, загрязнена она химическими веществами или нет.

Косвенные микробиологические показатели не указывают на наличие или отсутствие в почве других возбудителей инфекционных заболеваний (столбняка, сибирской  язвы, ботулизма), кишечника и других вирусов, патогенных для человека.

Для выделения или индикации  этих патогенных микроорганизмов необходимо проводить специальные исследования с использованием лабораторных животных в крупных бактериологических лабораториях или научных учреждениях. Описание этих методик приводится ниже в соответствующих  разделах Методических указаний.

В санитарно-бактериологических лабораториях районных санэпидстанций можно проводить  исследование почв на присутствие тифопаратифозных и сальмонеллезных возбудителей. Необходимость в проведении таких анализов возникает при расследовании вспышек, при установлении источника заражения, а также при проведении противоэпидемических мероприятий.[17]

 

 

 

4. Методы определения микроорганизмов, характеризующих загрязнение и самоочищение почвы от органических и химических загрязнений.

 

Общее количество бактерий и нитрификаторов дает определенное представление о течении процессов загрязнения и самоочищения почвы от органических и химических загрязнений, но далеко не полное. В связи с этим для более глубокого изучения этих процессов дополнительно применяется комплекс методов определения отдельных групп и видов почвенной микрофлоры: общая численность сапрофитных микробов, число споровых бактерий, аммонификаторов, целлюлозоразлагающих микроорганизмов и др.[18]

4.1 Определение общей численности почвенных сапрофитных микроорганизмов.

 

Напряженность микробиологических процессов  почвы коррелятивно связана с  размножением и активностью всей совокупности почвенных сапрофитных  микроорганизмов. Существуют несколько  методов определения численности  почвенных сапрофитов: посев почвы  на питательные среды, прямая и электронная  микроскопия. Практически применяются  первые два метода.

Определение общей численности  почвенных микроорганизмов на питательных  средах. Для более полного учета  общей численности сапрофитных  микроорганизмов этим методом рекомендуется  проводить диспергирование и  десорбцию клеток с поверхности  почвенных частиц следующим способом. Навеску почвы, используемую для  приготовления первого разведения, доводят путем добавления небольшого количества стерильной водопроводной  воды до пастообразного состояния. После  чего почва в пастообразном состоянии  растирается в течение 5 мин. Затем  готовят первое разведение (1:10) почвы  на стерильной водопроводной воде и  почвенная суспензия охлаждается  при 5 - 7° в течение 20 - 30 мин. По истечении  срока охлаждения производят раститровку почвенной суспензии обычным способом.

Посев производится на поверхности  почвенного агара, разлитого в чашки Петри. Термостатирование засеянных чашек ведется при 28 - 30 °C в течение 72 часов. Учет анализа и расчет общей численности почвенных микроорганизмов производится, как и при определении общего количества бактерий.

Определение общей численности  почвенных микроорганизмов методом  прямой микроскопии. При определении  численности почвенной микрофлоры наиболее достоверные результаты можно  получить при использовании методов  непосредственного учета микроорганизмов  в почве - прямой микроскопии. Желательно при этом пользоваться методом капилляроскопии по Перфильеву и Габе с последующей люминесцентной микроскопией. Обработка почвенной суспензии при этом проводится 1% раствором акридинового оранжевого. Этот метод дает возможность определить в 10 раз большее количество живых микробных клеток в 1 г почвы за счет учета клеток, сорбированных на почвенных частицах.

Для этого к 1 мл почвенного разведения 1:10 добавляется 1 - 2 капли красителя. Через 5 секунд в почвенную суспензию  помещают отрезок счетного капилляра (2 - 2,5 см). После заполнения капилляра  его помещают на предметное стекло и фиксируют двумя каплями  расплавленного парафина, нанося их на концы отрезка капилляра. Эти  парафиновые капли одновременно защищают содержимое каналов. После  этого приступают к подсчету общей  численности почвенных микроорганизмов  с помощью люминесцентного микроскопа при увеличении до 90 x 10.

Численность микроорганизмов в 1 г  почвы определяется по формуле:

 

                                   12

                             m x 10

                         Q = -------- x С,

                                И

 

    где:

    Q - количество  микроорганизмов в г изучаемого образца почвы;

    m - средняя   численность   микроорганизмов   в   одном   ходе

капилляра;

      12

    10   - объем  1 куб. см в кубических мк;

    И - объем одного  хода капилляра в кубических мк;

    С - кратность  разведения суспензии, которая  обычно равна 10.[19]

4.2 Определение общего числа и процента почвенных бацилл.

 

Этот показатель является индикатором  глубины минерализации органического  субстрата. В чистых почвах с окончившимся процессом самоочищения число бацилл относительно общей микробной обсемененности достигает 20 - 50%, в загрязненных сохраняется в пределах до 20%. Однако содержание бацилл и их процент колеблется в зависимости от почвенно-климатических условий, поэтому в конкретных условиях необходимо устанавливать величины этих микробиологических показателей.

Для учета бациллярных форм микроорганизмов  используются те же почвенные разведения, что и для определения общей  численности, предварительно прогретые  при 80 °C в течение 15 минут. Посев  может производиться на поверхность  среды, состоящей из 50% сусла и 50% мясо-пептонного агара (pH 7,0 - 7,2), на поверхность агара Сабуро или почвенного агара. Термостатирование и учет производятся аналогично, как и при учете общей численности микроорганизмов.

4.3 Определение количества грибов и актиномицетов в почве.

 

Данные по изучению загрязнения  почвы указывает на большую чувствительность к действию отдельных химических веществ почвенных актиномицетов  и грибов по сравнению с почвенными споровыми и неспоровыми бактериями. Несомненно, что такая разбалансировка равновесия в почвенном микробиоценозе должна рассматриваться как отрицательное явление. Актиномицетам и грибам принадлежит большая роль в превращении широкого круга органических и минеральных веществ и благодаря чрезвычайно выраженным антагонистическим и токсическим свойствам они оказывают большое влияние на формирование микробных почвенных ценозов, являются продуцентами многих физиологических активных веществ - аминокислот, ферментов, витаминов.

Для учета почвенных актиномицетов  и грибов используются те же разведения почвенной суспензии, что и при  учете общей численности микроорганизмов, те же методы посева и учета. Как  правило, для учета почвенных  грибов используют разведения почвенной  суспензии 1:10 - 1:100, а при учете  актиномицетов - 1:100 - 1:10000. Посев производят поверхностным способом, нанося на агаризованные среды 0,1 - 0,05 мл суспензий. Для учета актиномицетов используется чаще всего крахмало-аммиачный агар или агар Ваксмана, при учете грибов - сусло-агар или минеральная среда Чапека. При учете грибов используют добавление в среду веществ, ингибирующих рост бактерий, - концентрированную молочную кислоту в количестве 4 мл/л среды. Прибавление такого количества кислоты доводит pH среды до 4,0 - 4,5. Кислота добавляется непосредственно перед посевом в расплавленную среду. Поскольку прибавляют концентрированные кислоты, то их предварительно не стерилизуют.

4.4 Определение аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов.

 

Эта группа микроорганизмов осуществляет самоочищение почвы от остатков растительного  происхождения. Чаще всего для учета  этих микроорганизмов используют посев  разведений почвенной суспензии  в жидкую среду Гетчинсона. Среда разливается в колбочки или пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу; в колбочки опускают складчатый фильтр, в пробирки - полоски бумаги. Учет производится через 15 - 20 суток (инкубация при 28°) по разложению полосок фильтровальной бумаги и образованию колоний микроорганизмов на них.[20]

 

4.5 Определение аммонификаторов в почве.

 

Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на мясо-пептонном агаре, а при необходимости на жидких пептонных средах (мясо-пептонный бульон, пептонная вода) с индикаторными бумажками, открывающими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет) или полоски фильтровальной бумаги, пропитанные реактивом Круппа (от аммиака краснеют). При выращивании почвенных суспензий на мясо-пептонном агаре результаты выражают в количестве бактерий на 1 г почвы. При определении этого показателя в жидких средах определяют титр аммонифицирующих микроорганизмов по последней пробирке, в которой еще обнаруживается аммиак (на 10-е сутки) после термостатирования при температуре 25 - 30 °C.

4.6 Определение токсичности почв к микроорганизмам.

 

Метод определения степени токсичности  почв к микроорганизмам используется в качестве быстрого и достаточно чувствительного теста для получения  ориентировочных данных о самоочищающей способности почвы от патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Кроме того, этот тест оказался также чувствительным при определении влияния химических веществ на почвенный микробиоценоз. Низкая степень токсичности или ее снижение по отношению к патогенным микроорганизмам свидетельствует о наличии или возникновении более благоприятных условий для выживания возбудителей в таких почвах. К почвенным сапрофитам - наоборот: высокая или повышенная токсичность - явление неблагоприятное. Степень токсичности почв отдельных территорий оценивается по классам: