Санитарно-бактериологическое исследование питьевой воды. Оценка и оформление результата исследования

Для определения колифагов  в исследуемой воде используют качественный и количественный метод.

Для качественного метода применяют музейный штамм культуры кишечной палочки К12 FR, так как у данного штамма колифаги лизируют как ДНК так и РНК. На среде Эндо такой штамм образует колонии бе металлического блеска бледно – розового цвета с ровными краями.

Для работы штамм ежедневно пересеивают на косячок МПА, а один раз в неделю пересеивают на среду Эндо. Для хранения культуры готовят 0,3 – 0,7% полужидкий питательный агар и производят посев штамма уколом в столбик. Пробирка помещается в термостат- 37 0С на 24 часа, затем культуру заливают стерильным вазелиновым маслом и хранят в холодильнике 9срок хранения до 1 года). Для исследования законсервированной штамм пересеивают в МПБ, с МПБ на среду Эндо, с Эндо на косячок МПА.

Для постановки пробы на колифаги 20 мл. исследуемой воды в стерильную чашку Петри и добавляют 30 мл. 2% расплавленного питательного агара со взвесью культуры К12FR и оставляют до застывания. (Приготовление взвеси – в косячок МПА наливают 5 мл. стерильной дистиллированной воды.Культуру эмульгируют,вращая между ладонями до получения однородной массы. Затем в стерильную пипетку набирают 1 мл поученной эмульсии и переносят в пробирку с 5 мл. воды.Сравнивают со стандартом мутности 10 ЕД. Если при сравнении мутность совпадает, берут 0,3 мл. взвеси и смешивают с 30 мл. питательного агара). Чашки петри переворачивают и помещают в термостат. Для контроля в одну из чашек Петри наливают 30 мл. агара и 0,3 мл. взвеси культуры К12 FR, без пробы исследуемой воды. Термостат- 37 0С на 24 часа.

При количественном  исследовании колифагов

Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл. разлить на 6 объёмов: 1 флакон 50 мл. и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл. десятикратногопитательного бульона и 0,5 мл. взвеси бактерий E.coli К12FR. В каждые 10 мл. пробы внести по мл. десятикратного питательного бульона и 0,1 мл. взвеси бактерий E coli К12FR.

Для контроля 0,1мл. взвеси бактерий E coli К12FR помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Посевы инкубируют при температуре 37 0С на 24 часа.

2- й день исследования

ТКБ и ОКБ.

Титрационный метод. Просматривают посевы на ГПС. Если цвет среды не изменился, то дают отрицательный ответ сразу по двум показателям  ТКБи ОКБ. Например : при качественном методе- «ОКБ не обнаружены», при количественном методе- «ОКБ в 100 мл. отсутствуют».

Если во флаконах наблюдается разложение  до кислоты и газа (изменение цвета среды и всплывание  поплавков) или только до кислоты (изменение цвета среды). Делают пересев Эндо с фуксином и молоком. Термостат-370С на 24 часа. Если во флаконах с ГПС произошло разложение только до кислоты, то ТКБ не определяют. Посевы ставят  в термостат при температуре 370С и просматривают через 5-6 часов. Окончательный результат  учитывают через 18 часов.

Мембранный метод. Просматривают рост на чашках Эндо с  посеянными фильтрами. При наличии подозрительных колоний проводят оксидазный тест. Если тест на оксидазу положительный. То дальнейшее исследование не проводят, если тест на оксидазу отрицательный, то ведётся дальнейшее исследование – пересев на полужидкую глюкозу и среду Олькеницкого.

Термостат-370С на 24 часа.

Определение ОМЧ. Подсчитывают число выросших колоний на обоих чашках, складывают и делят на два.

Сульфитредуцирующие клостридии. Просматривают посевы. При отсуствии роста выдают отрицательный результат. Если среда с разрывами и образовались белые пушистые колонии, то результат на среде вырастают чёрные или тёмно-коричневые колонии чечевицеобразной формы с почернением вокруг среды. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Грамму и микроскопируют с иммерсионной системой. При положительном результате  в мазках обнаруживают грамположительные палочки с обрубленными краями и спорами, расположенными терминально.

Количественному учёту подлежат  только те посевы, где получены изолированные колонии.

Результат анализа выражают числом колонеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 мл. воды

При отсуствии роста чёрных колоний дают ответ «не обнаружено» в 20 мл. воды».

При невозможности учёта колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный , в протоколе отмечают «обнаружено в 20 л.».

При необходимости получения количественного результата анализ повторяют

Колифаги.

При качественном исследовании

Просматривают чашки с посевами. На контрольной чашке роста и зон лизиса не должно быть. При наличии на остальных чашках роста без негативных бляшек, выдают отрицательный результат. Если бляшки есть, выдают положительный результат. Результат выдаётся с формулировкой «Колифаги в пробе не обнаружены» или «Колифаги в пробе обнаружены».

При количественном  исследовании колифагов.

После инкубации из объёма 50 мл. отлить в пробирку 10 мл. Вовсе исследуемые 6 объёмов добавить по 1 мл. хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками. Энергично встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объёму пробы

и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин. Для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45 0С питательны агар добавить приготовленную взвесь бактерий E coli К12FR из расчёта 1,0 мл. взвеси на 100 мл. агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры  E coli К12FR на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль E coli К12FR

После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить  на 6 секторов, промаркировать  их в соответствии с исследуемыми объёмами. На каждый сектор  из соответствующей пробирки или флакона нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлёй продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа).

После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить  в термостат 370с на 24 часа.

3-й день исследования

ТКБ и ОКБ

Титрационный метод. Если на среде Эндо роста нет, то ставят отрицательный ответ. Если на среде Эндо обнаруживают тёмно-красные колонии с металлическим блеском или без него. То дают положительный ответ о присутствии ОКБ.

Если колонии розовые, то ставят оксидазный тест. При отрицательном результате на оксидазу производят посев на положительную глюкозу для определения ОКБ. Для определения ТКБ пересев производят на полужидкую лактозу. Термостат 440С на 24 часа.

Мембранный метод. Производят учёт роста на полужидкой глюкозе. Если глюкоза не разжижилась или разложилась только до кислоты, то ставят отрицательный результат. Если глюкоза разложилась до кислоты и газа определяют НВЧ ОКБ и ТКБ по таблице МУКа.

Колифаги.

 Учёт результатов: просмотр  результатов осуществляется в  проходящем свете. Учёт проводится  по наличию зон просветления (лизиса) на секторах газона E coli К12FR.

При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлёй отмечается лизис по ходу штриха.

Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Оценка проводится по таблице. В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл. воды и диапозон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел-верхний предел) колифагов 100 мл. Результат полуколичественный.

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным.

4-й день исследования.

ОКБ и ТКБ.

Титрационный метод. Производят учёт роста на полужидкойглюкозе и лактозе. Если углеводы не разложились только до кислоты, то ставят отрицательный результат. Если углеводы разложились до кислоты и газа определяют НВЧ и ТКБ по таблице МУКа.

 

Расчёт  наиболее вероятного числа бактерий в 100мл питьевой воды

Число положительных результатов из			НВЧ бактерий В 100 мл	Доверительный интервал (95%)
3 объёмов по 100мл	3 объёмов по 10 мл	3 объёмов По 1 мл		Нижний         верхний
1	2	3	4	5	6
0	0	1	0,3	0	1,4
0	0	2	* <*>
0	0	3	*
0	1	0	0,3	0,1	1,4
0	1	1	*
0	1	2	*
0	1	3	*
0	2	0	0,6	0,1	2,8
0	2	1	*
0	2	2	*
0	2	3	*
0	3	0	*
0	3	1	*
0	3	2	*
0	3	3	*
1	0	0	0,4	0,1	1,7
1	0	0	0,7	0,2	3,4
1	0	2	*
1	0	3	*
1	1	0	0,7	0,2	3,4
1	1	1	1,1	0,2	5,2
1	11	2	*
1	1	3	*
1	2	0	1,1	0,2	5,3
1	2	1	*
1	2	2	*
1	2	3	*
1	3	0	*
1	3	1	*
1	3	2	*
1	3	3	*
2	0	0	0,9	0,2	4,3
2	0	1	1,4	0,3	6,7
2	0	2	*
2	0	3	*
2	1	0	1,5	0,3	6,9
2	1	1	2	0,4	6,9
2	1	1	2	0,4	9,6
2	1	2	*
2	1	3	*
2	2	0	2	0,5	9,9
2	2	1	3	0,6	12,9
2	2	2	*
2	2	3	*
2	3	0	3	0,6	13,3
2	3	1	*
2	3	2	*
2	3	3	*
3	0	0	2	0,5	10,8
3	0	1	4	0,8	18,0
3	0	2	6	1,4	29,7
3	0	3	*
3	1	0	4	0,9	20,0
3	1	1	8	1,6	35,0
3	1	2	12	2,5	53,8
3	1	3	*
3	2	0	9	2,0	43,6
3	2	1	15	3,2	69,8
3	2	2	21	4,6	100,3
3	2	3	29	6,2	136,4
3	3	0	24	5,1	112,1
3	3	1	46	9,3	216,0
3	3	2	110	23,5	516,6
3	3	3	>=240	-	-

<*> Вероятность ниже допустимого  уровня. Количественный учёт невозможен, результат оценивается качественно.

 

 

 

Методы санитарно-паразитологического исследования проб питьевой воды и их концентратов

 Метод порошковой фильтрации

Оборудование: отборник флотанта фильтрующий "ОФФ-25" в комплекте, центрифуга с качающимся ротором с прозрачными пластиковыми или стеклянными центрифужными стаканчиками объемом 100 - 150 мл.

Расходные материалы: аналитические трековые мембраны (АТМ) с диаметром диска 25 мм.

Реактивы и красители: раствор Люголя, красители или флуорохромы, флуоресцентно-меченые антитела, промывочные и фиксирующие растворы, флотирующая жидкость.

Порядок приготовления препарата для микроскопического исследования:

- взбалтывают смыв в бутылке  и разливают по центрифужным стаканчикам, доливают дистиллированной воды до верха стаканчика;

- центрифугируют в качающемся  роторе со скоростью 1000 - 1500 об./мин., 10 мин.;

- удаляют надосадочную жидкость.

Примечание 1.

Целесообразно провести предварительное отстаивание концентрата с целью уменьшения объема осадка. Для этого взбалтывают смыв ПробоКонга и дают ему отстояться 10 мин. для оседания крупной фракции. Надосадочную жидкость помещают в центрифужные пробирки. Полученный осадок также можно исследовать методом иммуномагнитной сепарации (п. 5.2) или ПЦР (п. 5.3);

- к осадку (примерно 20 мл без  предварительного отстаивания) приливают  флотирующую жидкость, объем которой  должен в 5 раз превышать объем  осадка (примерно 100 мл);

- осадок тщательно взбалтывают  стеклянной палочкой и отмечают на стенке пробирки маркером уровень жидкости;

- наслаивают сверху 5 - 10 мм дистиллированной  воды или применяемого физиологического  раствора.

Примечание 2.

Наслоение воды или физраствора предотвращает прилипание зерен к стенкам пробирки и возможное последующее загрязнение ими препарата для микроскопирования, а также испарение воды из флотирующей жидкости с выпадением кристалликов соли на объектах, приводящим к их "потоплению".

Не рекомендуется наслаивать водопроводную воду, т.к. ионы кальция и магния, содержащиеся в ней, образуют нерастворимые сульфаты при контакте с флотирующей жидкостью на основе сульфата цинка, что приводит к помутнению флотанта и возможной забивке микропористой мембраны;

- центрифугируют со скоростью 1500 - 2000 об./мин. 10 мин., при этом паразитарные агенты всплывают, а частицы порошкового фильтра оседают.

Примечание 3.

Стаканчики в роторе должны быть установлены в предназначенные для них ячейки, недопустимо устанавливать их в ячейки или стаканчики большего диаметра так, чтобы они могли раскачиваться (совершать прецессию) во время центрифугирования, что приводит к перемешиванию границы слоев растворов.

Не рекомендуется останавливать центрифугу тормозом;

- с помощью отборника флотанта  фильтрующего ОФФ-25 (по прилагаемой  инструкции) отбирают флотант на прозрачную трековую мембрану, промывают ее дистиллированной водой от флотирующей жидкости, обрабатывают красителями или флуоресцирующими антителами.

Примечание 4.

При отсутствии ОФФ-25 флотант можно отсосать пипеткой и перенести в центрифужную пробирку, разбавить не менее чем в 5 раз дистиллированной водой, центрифугировать 5 мин. при 1500 об./мин., надосадочную жидкость удалить, из осадка готовить препараты для микроскопирования или исследовать его методом иммуномагнитной сепарации или ПЦР;

- на чистое предметное стекло  наносят палочкой для иммерсионных  жидкостей каплю глицерина и  размазывают боковой поверхностью  этой палочки на участке под  фильтр;

- извлекают из ОФФ-25 мембрану  пинцетом (согласно инструкции), касаются  ее нижней стороной фильтровальной бумаги для удаления возможных капель воды и укладывают, постепенно опуская ее, начиная с края, на подготовленное предметное стекло, следя, чтобы не образовывались под мембраной пузыри; для лучшего пропитывания мембраны глицерином следует подождать несколько минут.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вывод:

             Поскольку вода используется при производстве любого вида продукции, а также в пищу, соответствие ее качества санитарно- микробиологическим показателям чрезвычайно важно. Водным путем могут передаваться кишечные инфекции - холера, брюшной тиф и паратифы, сальмонеллез, дизентерия, гепатит А, полиомиелит, а также лептоспирозы, сибирская язва, туляремия, туберкулез, сап, Ку-лихорадка, различные грибковые заболевания. Для того, чтобы предупредить различные инфекционные заболевания, необходимо проводить мониторинг исследования питьевой воды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список использованной литературы:

 

1.Санитарные правила и нормы. «Питьевая вода. Гигиенические требования  к качеству воды централизованных систем водоснабжения. Контроль качества» СП 2.1.4.1074-01