Производство алкогольных напитков

Дрожжи сохраняют жизнеспособность в пределах рН среды от 2 до 8. Для их выращивания оптимальным является рН 4,8—5.

При рН ниже 4,2 дрожжи продолжают развиваться, тогда как развитие молочнокислых бактерий прекращается. Это свойство дрожжей используют для подавления развития бактерий в инфицированной среде, которую подкисляют до рН 3,8 — 4 и выдерживают определенное время.

СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ДРОЖЖЕЙ

Потребность дрожжей в питательных веществах

О потребности дрожжей в питательных веществах судят по их химическому составу, который зависит от питательной среды, условий культивирования дрожжей и их физиологических особенностей. Средний элементарный состав дрожжевых клеток (в %): углерод 47, водород 6,5, кислород 31, азот 7,5—10, фосфор 1,6—3,5. Содержание других элементов незначительно: кальция 0,3—0,8%, калия 1,5—2,5, магния 0,1—0,4, натрия 0,06—0,2, серы 0,2%. В дрожжах найдены микроэлементы (в мг/кг): железо 90—350, медь 20—135, цинк 100—160, молибден 15—65.

Дрожжи в отпрессованном виде содержат 68—76% воды и 32 — 24% сухого вещества. Внутриклеточной влаги в зависимости от со стояния коллоидов дрожжевой клетки содержится 46—53% и межклеточной 22-27%. При изменении общей влажности дрожжей меняется соотношение между количеством внутриклеточной и межклеточной влаги. Удаление 85% воды из дрожжей при температуре не выше 50°С почти не влияет на их жизнеспособность.

Сухие вещества дрожжей включают 23—28% органических веществ и 5—7% золы. Органические вещества состоят из 13—14% белка, 6—8% гликогена, 1,8—2% целлюлозы и 0,5—2% жира.

Белок. Дрожжи содержат в среднем 50% «сырого» белка в пересчете на сухие вещества и около 45% истинного белка. В состав сырого белка входят все соединения азота, к которым относятся производные нуклеиновых кислот — пуриновые и пиримидиновые основания, азот свободных аминокислот.

Гликоген. При отсутствии питательных веществ в среде гликоген дрожжевой клетки превращается в спирт и диоксид углерода.

Трегалоза. Наряду с гликогеном содержится трегалоза — очень мобильный резервный углевод, обусловливающий стойкость хлебопекарных дрожжей. Содержание трегалозы возрастает с уменьшением азота и при рН ниже 4,5.

Жир. В состав жира входят в основном олеиновая, линолиновая и пальмитиновая кислоты. Он содержит 30—40% фосфатидов.

Зола. Зола состоит из следующих основных окислов (в %): Р2О5 — 25—60, К2О — 23—40, СаО — 1—8, МgО — 4—6, Nа2О — 0,5—2, SО3 — 0,5—6, 5Ю2 — 1—2, Ре2О3 — 0,05—0,7.

Фосфор. Фосфор содержится преимущественно в виде органических и неорганических орто-, пиро- и метафосфатов. Они входят в состав молекул нуклеиновых кислот, фосфолипидов и коферментов типа аденозинфосфата и тиамина. Так, ядерное вещество клетки (нуклеопротеиды) содержит фосфор в видеортофосфата. В виде ортофосфата фосфор входит также в состав флавиновых ферментов; в виде пирофосфата — во многие коферменты (кодегидразы Кох и Коц, карбоксилазы), В виде различных соединений фосфор принимает важное участие в энергетических процессах клетки.

Сера. Сера входит в состав очень важных соединений — аминокислот (цистеин, цистин, метионин и глютатион) и витаминов (биотин, аневрин). В ферментах сера находится в виде сульфидных и тиоловых групп.

Железо. Железо содержится в цитохромах, цитохром-оксидазе, пероксидазе, каталазе и других ферментах, участвующих в процессе дыхания. Оно участвует в работе других ферментов (зимогеназа, пирофосфатаза).

Магний. Магний активирует действие многих фосфатаз и энолазы. Ионы магния влияют на сохранение активности ферментов при нагревании. Магний и марганец ускоряют потребление дрожжами глюкозы. Влияние магния тем сильнее, чем ниже концентрация глюкозы в среде. Питательные среды должны содержать 0,02-0,05% магния в виде сульфата. Процессы брожения регулируются изменением концентрации ионов магния в результате присоединения его к органическим веществам. 
    Калий. Калий необходим не только как питательный элемент, но и как стимулятор размножения дрожжей. Стимулирующее действие объясняется его существенной ролью в окислительном фосфорилпровании и в процессах гликолиза. Движение неорганического фосфора внутрь клетки специфично стимулируется калием. Калий активирует дрожжевую альдолазу, необходим для действия фермента пируваткарбоксилазы и влияет, так же как азот и сера, на липидный обмен дрожжевых клеток.

Кальций. Кальций играет роль активатора в микробной клетке и обнаруживается в ней как в свободной форме, так и в связанной с протеинами, углеводами и липидами. Ионы Са2+ могут связываться с АТФ наряду с Мg2+ и Мn2+. Кальций является кофактором транскетолазы хлебопекарных дрожжей и ингибитором некоторых ферментов, например пирофосфатазы, энолазы и адено-зинтрифосфатазы. Повышенное содержание солей кальция угнетает размножение дрожжей, снижает накопление в них гликогена и повышает содержание стеринов. Так, при содержании Са2+ до 40 мг на 1 л среды стимулируется размножение дрожжей, при большем оно угнетается.

Микроэлементы. Микроэлементы также имеют важное значение для размножения и жизнедеятельности дрожжей, входя в состав ферментов, витаминов и других соединений, участвующих в их синтезе. Они влияют на скорость и характер различных биохимических процессов. Например, кобальт стимулирует размножение дрожжей, повышает содержание в клетках азотистых веществ небелковой природы, прежде всего ДНК, РНК и свободных аминокислот. Он стимулирует также синтез витаминов — рибофлавина и аскорбиновой кислоты. Стимулирующее действие микроэлементов объясняется тем, что они образуют с ферментами металлорганические и внутрикомплексные соединения. Получаемый эффект зависит от прочности связи фермента с молекулой субстрата или активации субстрата в промежуточном активном комплексе.

Витамины и другие факторы роста дрожжей. Для нормального развития и спиртового брожения дрожжи нуждаются в витаминах, которые являются кофакторами многих ферментов. Дрожжи (сахаромицеты) в большей или меньшей мере могут синтезировать все витамины, за исключением биотина, который должен обязательно содержаться в питательной среде.

Ненасыщенные жирные кислоты с 18 атомами углерода, особенно олеиновая, также являются важными ростовыми факторами. Стимулирующее влияние олеиновой кислоты наблюдается только при малой ее концентрации, не превышающей 0,5 мг/мл. При увеличении концентрации рост дрожжей намного замедляется.  

 

 

  

 

Источники питания

Различают экзогенное и эндогенное питание дрожжей. При экзогенном питании питательные вещества поступают в дрожжевую клетку из внешней среды, при эндогенном дрожжи используют (в основном при голодании) свои резервные вещества: гликоген, трегалозу, липиды, азотистые соединения.

Углеродное питание. Дрожжи (Sacch. cereviesiae) используют углерод из различных органических соединений: глюкозы, маннозы, галактозы, фруктозы (D-формы). Пентозы Sacch. cereviesiae не ассимилирует. В отсутствие гексоз источником углерода для дрожжей могут служить также глицерин, маннит, этиловый и другие спирты, органические кислоты (молочная, уксусная, яблочная, лимонная).

Следует учитывать полиауксию — последовательность потребления различных источников углерода дрожжевой клеткой. При периодическом культивировании в первую очередь потребляются глюкоза и фруктоза. Последовательность усвоения жирных кислот зависит от расы применяемых дрожжей и состава этих кислот. Например, уксусная кислота препятствует потреблению молочной, а молочная — гликолевой. Уксусная кислота и глюкоза усваиваются одновременно. Как правило, в первую очередь усваивается из смеси тот источник углерода, который обеспечивает большую скорость роста дрожжей.

При непрерывном культивировании дрожжей с увеличением скорости разбавления среды в ней остается больше углеродного компонента, который усваивается последним.

Различные виды дрожжей неодинаково относятся к ассимиляции одних и тех же веществ. Например, дикие дрожжи Cand. natalensis, Cand. parapsilosis хорошо усваивают галактозу, а Cand. clausseni совсем не усваивают ее. Дрожжи Sacch. cereviesiae начинают сбраживать галактозу только со вторых суток.

Дисахариды, из которых спиртовые дрожжи усваивают мальтозу и сахарозу, предварительно подвергаются гидролизу соответствующими ферментами дрожжей до моносахаридов. При переходе дрожжей от анаэробных условий к аэробным ослабляется их способность сбраживать глюкозу и мальтозу, а сахаразная активность повышается в 2,5 раза. Дрожжи потребляют мальтозу только при отсутствии в среде фруктозы и глюкозы. Мальтоза сбраживается почти полностью в стационарную фазу роста дрожжей.

Органические кислоты имеют важное значение в метаболизме углерода, энергетическом обмене микроорганизмов, синтетических и диссимиляционных процессах. Использование кислот жирного ряда в качестве источника углерода зависит от вида и расы дрожжей, концентрации кислоты, длины ее углеродной цепи и степени электролитической диссоциации. Хорошими субстратами служат кислоты с длиной углеродной цепи от С2 до С4 (уксусная, пировиноградная, молочная, масляная и др.) при сравнительно низкой концентрации. Калийные соли кислот, содержащих в молекуле от 2 до 5 атомов углерода, стимулируют рост дрожжей в 1,4—3,3 раза по сравнению с соответствующими кислотами.       

Жирные кислоты со средней длиной углеродной цепи (от С6 до С10) в меньшей мере потребляются дрожжами и при очень низких концентрациях в среде (0,02—0,05%). Более высокие концентрации их подавляют развитие дрожжей. Жирные кислоты с 12—17 атомами углерода в молекуле потребляются избирательно в зависимости от рода и вида дрожжей.

Любой из промежуточных продуктов цикла Кребса (пировиноградная, лимонная, янтарная, фумаровая, яблочная кислоты) дрожжи могут использовать в качестве единственного источника углерода.

Азотное питание. Дрожжи способны синтезировать все аминокислоты, входящие в состав их белка, непосредственно из неорганических азотистых соединений при использовании в качестве источника углерода органических соединений — промежуточных продуктов распада углеводов, которые образуются при дыхании и брожении.

Дрожжи Sacch. cereviesiae усваивают лишь две формы азота: аммиачный и органических веществ. Они эффективно используют азот сульфата и фосфата аммония, мочевины, аммиачных солей уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот. В присутствии сбраживаемых Сахаров аммиачные соли являются для дрожжей источником лишь азота; однако при потреблении его освобождаются кислоты, изменяющие рН среды. Аммиачный азот усваивается дрожжами лучше, чем азот многих аминокислот.

Аминокислоты являются одновременно источником азота и углерода, причем последний усваивается из кетокислот, образующихся в результате отщепления аминогрупп. Возможна и непосредственная ассимиляция аминокислот из питательной среды, содержащей их полный набор и какой-либо сбраживаемый сахар. Вследствие этого снижается расход сахара среды на питание дрожжей и несколько увеличивается выход спирта при брожении.

Ассимиляция аминокислот обеспечивает синтез белка, в том числе и ферментов, активирует некоторые уже имеющиеся в клетке ферменты, ускоряет процесс почкования дрожжевых клеток.

Для потребления органического азота (аминокислот, амидов) многим дрожжам необходимы витамины (биотип, пантотеновая кислота, тиамин, пиридоксин и др.). Такие азотистые соединения, как белки, бетаин, холин, пурины и амины в виде этиламина, пропил- и бутиламина, дрожжи не усваивают. Пептиды занимают среднее положение между аминокислотами и белками. Потребление пептидов снижается с повышением их сложности. Присутствие некоторого количества пептидов в среде наряду с другими формами азота способствует потреблению аминокислот.

На образование 10 млрд. дрожжевых клеток расход азота в условиях анаэробиоза составляет 66—77 мг, в условиях аэробиоза 37—53 мг. По содержанию азота в дрожжах судят об условиях их культивирования и физиологическом состоянии. Содержание азота в дрожжах кроме аэрации зависит от состава среды, количества дополнительно вводимых питательных веществ и от расы дрожжей. Общего азота в дрожжах спиртовых заводов содержится 7—10% (иногда до 12%) на сухое вещество.

Фосфорное питание. В анаэробных условиях дрожжи усваивают фосфор главным образом в начальный период брожения, когда потребление его составляет 80—90% от максимального содержания в дрожжах. Молодые, энергично размножающиеся дрожжевые клетки богаче фосфором по сравнению с непочкующимися старыми. Например, после 6 часов брожения дрожжи содержат 2,15% фосфора на сухое вещество, к концу брожения — только 1%.

В сусле из крахмалистого сырья содержится достаточное количество усваиваемых дрожжами фосфорсодержащих соединений, в мелассном сусле их недостаточно, и приходится добавлять ортофосфорную кислоту. 

 

БИОХИМИЯ БРОЖЕНИЯ И ДЫХАНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ

 

 

АНАЭРОБНЫЙ РАСПАД УГЛЕВОДОВ

Ферментативная диссимиляция углеводов в анаэробных условиях, происходящая с выделением энергии и приводящая к обра зованию продуктов неполного окисления, называется брожением.  

 

 

 

При брожении акцептором водорода служат органические соединения, получающиеся в реакциях окисления (например, уксусный альдегид при спиртовом брожении); кислород в этих реакциях не участвует.  

 

На рисунке приведена схема химических превращений при спиртовом брожении глюкозы.

1. Образуются фосфорные  эфиры Сахаров. Под действием  фермента гексокиназы и адениловых кислот, являющихся донаторами и акцепторами фосфорной кислоты, глюкоза превращается в глюкопиранозо-6-фосфат. Адениловые кислоты в дрожжах содержатся в виде аденозинмонофосфата (АМФ), аденозиндифосфата (АДФ) и адеыозинтрифосфата (АТФ). Гексокиназа катализирует перенос одной фосфорной группы с АТФ на глюкозу. При этом АТФ превращается в АДФ, а остаток фосфорной кислоты присоединяется по месту шестого углеродного атома. Действие фермента активируется ионами магния. Подобным образом происходит превращение D-фруктозы и D-маннозы. Глюкокиназная реакция определяет скорость процесса брожения.

2. Глюкозо-6-фосфат  под действием фермента глюкозофосфат — изомеразы подвергается изомеризации — превращению в фруктозо-6-фосфат. Реакция обратима и сдвинута в сторону фруктозо-6-фосфата.