Техника и методика приготовления и извлечения материала из парафиновых блоков

Для изготовления парафиновых блоков берут парафин особых сортов, которые отличаются чистотой, однородностью и аморфностью. Исследуемый материал, предварительно обезвоженный и находящийся в абсолютном спирте необходимо перед заливкой пропитать парафином. Для этого спирт из материала постепенно удаляют, заменяя его каким-либо растворителем, в котором хорошо растворяется парафин (хлороформ, ксилол, толуол или кедровое масло). Обычно материал переносят в смесь спирта и растворителя парафина (например, хлороформа) различных соотношений (2:1, 1:1, 1:2), затем в чистый растворитель. Каждый раз материал оставляют в новой смеси на несколько часов или несколько дней в зависимости от структуры и размера объекта. После этого необходимо заменить растворитель на парафин, т. е. пропитать материал парафином. Эта операция осуществляется также плавно и постепенно, как и предыдущая. Здесь возможны два пути: 1) постепенно переносить материал в смесь растворителя и парафина с возрастающей концентрацией парафина, выдерживая его каждый раз определенное время; 2) материал поместить в растворитель, к которому постепенно добавлять все новые порции парафина. Через 2—3 дня объект в растворе парафина помещают в термостат при температуре 35—40° С и продолжают прибавлять парафин, а через 2—3 дня постепенно удаляют растворитель, после чего объект переносят в чистый парафин'(жидкий) и выдерживают в термостате. Убедившись, что материал хорошо пропитан парафином, приступают к заливке его в парафин. В специальные сосуды или в коробочки, сделанные из бумаги или оловянной фольги, наливают расплавленный парафин, помещают туда пропитанный парафином материал и охлаждают (по возможности быстро, так как быстрое затвердение обеспечивает аморфность парафина), придав объекту нужное положение в парафине. После затвердения парафина его вынимают из сосуда и парафину придают нужную форму, удаляя лишний парафин скальпелем или бритвой (т. е. готовят блок). Готовый блок с заключенным в нем объектом наклеивают на призматический кусок дерева размером примерно 3 х 2 х 1,5 см. Деревяшка перед наклеиванием блока должна быть прокипячена в парафине Нагревая поверхность блока и поверхность деревяшки с наплавленным на нее кусочком парафина, соединяют их и быстро охлаждают

 

Во время приготовления постоянных микроскопических препаратов после проводки проводят закапывание блоков. Для этого разогревают бюкс с парафином и материалом на «поросенке» совместно с бюксом, где находится чистый парафин.

На одну из поверхностей деревянного блока наносят каплю парафина и горячим скальпелем распределяют по одной из поверхностей.

На эту поверхность специальной пипеткой капают каплю парафина, при этом водят по часовой стрелке пипеткой, наращивая объем капли парафина (это делается быстро, для того чтобы была одинаковая температура слоев парафина, иначе он будет крошиться). 

Сразу же после этого быстро ложится материал в подготовленную каплю парафина и аналогично добавляют пипеткой парафин сверху до нужной высоты (чтобы не было видно материала). 

Материал можно встраивать под нужным углом нагретым скальпелем (но быстро!). Сбоку на блок клеится номер (достаточно макнуть бумажку в горячий парафин, надпись делается простым карандашом).

После этого дают бюксу с парафином и материалом застыть, предварительно выложив на застывающую поверхность парафина номерок (парафин должен полностью покрывать материал). Приготовленные блоки обрезаются лезвием бритвы в виде трапеции (меньшая основа – верх, большая – низ), почти до самого материала (объект во время закапывания ориентируется в нужном направлении и плоскости, в зависимости от того, какие нужны срезы). Подрезать лучше пока парафин не полностью задубел.

Если парафин с материалом вдруг полностью отпал, его можно приклеить горячим скальпелем подплавляя края трапеции. Данные блоки готовы к дальнейшему нарезанию на микротоме.

Очень мелкий материал вырезается из пряников кубиками (семена). Шпателем разогревается капля на блоке и одновременно нижняя сторона кубика, они сразу же накладываются. Разогретым шпателем со всех сторон сглаживают границы прикрепления.

 

Приготовление парафиновых блоков

Пропитанные парафином кусочки ткани выкладывают в специальные формочки и заливают расплавленным в термостате или на водяной бане при 60 °С парафином, в который добавлено 1-3 % воска. 

 

Для получения парафиновых блоков нужной формы используют различные приспособления:

1.                              изготовляемые самим лаборантом бумажные коробочки, на дно которых выкладывают кусочки, а рядом к боковой стенке ставят этикетку номером кнаружи;

2.                             металлические Г-образные угольники или разъемные формочки, которые перед употреблением смазывают глицерином и помещают на нагретую металлическую пластинку, выполняющую роль дна формочек;

3.                             различные пластмассовые коробочки и формы, в частности используемые в микробиологии, особенно при заливке мелких объектов, таких как материал пункционных биопсий.  

 

Специальные импортные аппараты для заливки в парафин (так называемые заливочные центры) снабжены набором различных формочек (кассет) и пинцетов. В них обеспечивается автоматическая подача дробных доз парафина оптимальной температуры.

Раскладывание кусочков в формочки и их ориентирование нужно проводить быстро теплым пинцетом. Если материала для заливки много и он быстро остывает, то можно использовать парафин, подогретый на водяной бане до 60 °С. Для охлаждения формочки с материалом рекомендуют помещать в воду при 10- 18 °С, но не погружать в нее. При застывании парафина поверхность блока стягивается, и в нем образуется кратерообразное углубление. Это нужно учитывать при заливке кусочков и в дальнейшей работе с блоками. Парафин должен на 3-4 мм выступать над поверхностью блока, если предстоит монтировать его на деревянную колодку. Возможны также заливка блока большим количеством парафина и резка без использования деревянных колодок, с успехом применяемая даже на санном микротоме.

В большинстве руководств рекомендуют после подравнивания и удаления лишнего парафина наклеивать блоки на деревянные бруски с помощью подогретого на спиртовке металлического шпателя или скальпеля. Затем для обеспечения более прочного приклеивания основания блок оплавляют с четырех боковых сторон тем же горячим шпателем или скальпелем.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий:

1) препарат должен быть полностью  обезвожен,

2) не должен содержать спирт.

Первое условие, как мы уже знаем, обеспечивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.

 

 

 

 

ЗАЛИВКА После окончательного пропитывания объекта его заливают расплавленным парафином, специально приготовленным для этих целей и хранящимся в термостате. В качестве формочек для заливки используют разнообразные приспособления. Г-образные гладкие угольники изготовляют из металла (латунь, свинец, сталь). Рекомендуется применять угольники, длинная сторона которых равна 8—10 см, короткая — 3 см, высота — 1,5—2 см. Угольники кладут на отполированную металлическую или стеклянную пластину и, сдвигая углы, создают формочку нужных размеров.

 

Бумажные коробочки  изготовляют из листка плотной бумаги  по схеме, представленной на рисунке, где порядок номеров указывает очередность, а линии — направление сгибания листка

 

 

Применяют также фольгу, только в этих случаях следует сразу после заливки еще в жидкий парафин погрузить часть бумажной этикетки. Удобство бумажных формочек заключается в возможности значительно варьировать их размеры, простоте маркировки (простым карандашом на стенках) и длительном хранении залитого материала. Для заливки мелких объектов можно применять часовые стекла, четырехугольные фарфоровые ванночки из-под акварельной краски и другие приспособления.

Заливку осуществляют следующим образом. Предназначенный для заливки парафин подогревают до 58—60°С и аккуратно наливают в приготовленную формочку, заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха (хорошо иметь для этих целей высокую фарфоровую кружку ручкой и носиком). Затем подогревают пинцет или металлический шпатель, быстро переносят подготовленный заливке объект в формочку с парафином и ориентируют в необходимом положении.

 

После этого формочку охлаждают водой (10—18°С). Если заливку производят с помощью металлических угольников, то пластину помещают в плоскую чашку таким образом, чтобы нижняя ее поверхность не соприкасалась с дном сосуда (на стеклянные или металлические палочки). Затем осторожно наливают воду до верхних краев формы (не заливая поверхность) и дают парафину застыть. При заливке в бумажной коробочке ее постепенно опускают в сосуд с водой и оставляют плавать до полного застывания парафина.

В процессе застывания поверхность блока кратерообразно стягивается, что необходимо учитывать при выборе высоты формы. Если форма недостаточно высокая или залита не полностью и парафин лишь тонким слоем покрывает объект, то при застывании верхняя часть кусочка будет выступать из блока. Наклейку блоков производят на деревянные кубики.

 

Для этого из затвердевшего парафина скальпелем вырезают четырехугольный блок таким образом, чтобы объект со всех сторон был окружен слоем парафина толщиной 1-3 мм.  

Затем, положив на деревянный кубик небольшой кусочек твердого парафина, расплавляют его горячим металлическим шпателем (или скальпелем), проводят этим же шпателем по нижней поверхности парафинового блока и быстро придавливают его к кубику.

Рак легкого классифицируется по нескольким группам признаков – по клеточному строению, по типу роста (локализации его в легком), по форме опухоли и по распространенности ее в организме человека (стадия).

Различные типы классификации позволяют планировать необходимое в том или ином случае лечение и с большей степенью вероятности прогнозировать результат лечения.

Классификация рака легкого:

А) Морфологическая классификация рака легкого

1. Мелкоклеточный рак 

2. Плоскоклеточный рак

3. Аденокарцинома 

4. Крупноклеточный рак 

5. Смешанный 

Б) Анатомическая классификация рака легкого

1. Центральный рак 

2. Периферический рак.

Мелкоклеточный рак легких (МРЛ) составляет около 20% случаев рака легких. Из всех видов рака легких эта опухоль является самой агрессивной и быстро растущей.

Возникновение мелкоклеточного рака легких четко связано с курением, и лишь в 1% из всех случаев появляется у некурящих людей. Эта форма рака быстро метастазирует в различные участки организма.

Чаще всего рак обнаруживается уже после своего распространения. При исследовании образцов ткани МРЛ под микроскопом, за специфический вид клеток, данный вид рака иногда называют овсяноклеточной карциномой. В клинической картине преобладают симптомы, обусловленные наличием регионарных и отдаленных метастазов.

МРЛ классифицируется по двум стадиям:

Локализованный опухолевый процесс - рак ограничен зоной своего образования в грудной полости.

Распространенный опухолевый процесс - рак распространился за пределы грудной полости на другие органы.

Немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) является самым распространенным типом рака. На его долю приходится около 80% случаев рака легких.

Исходя из названия клеток, которые обнаруживаются в опухоли, НМРЛ можно разделить на 3 основных вида:

Самым частым видом НМРЛ являются аденокарциномы. На их долю приходится до 50% всех случаев НМРЛ. Развитие аденокарциномы, как и других типов рака легких, связано с курением, но эта опухоль также встречается и у некурящих людей. Аденокарцинома развивается сравнительно медленно, но чаще приводит к раннему поражению плевры и гематогенному метастазированию. Большинство аденокарцином образуется в периферических, или наружных участках легких. Подтипом аденокарциномы является бронхиолоальвеолярная карцинома. Она часто распространяется по стенкам существующих альвеол и развивается в различных отделах легких.

Раньше чаще, чем аденокарцинома встречалась сквамозно-клеточная карцинома. На ее долю в настоящее время приходится около 30% всех случаев НМРЛ. Сквамозно-клеточные опухоли, также известные как плоскоклеточная (эпидермоидная) карцинома, чаще всего формируются в центральной части грудной клетки в бронхах.

Наименее распространенным типом НМРЛ является крупноклеточная карцинома, также известная как недифференцированный рак.

Встречаются также комбинации различных типов НМРЛ.

НМРЛ делится на 4 стадии:

Стадия I: опухоль не выходит за пределы легких.

Стадия II и III: опухоль распространяется на грудную полость (при этом стадия III соответствует более крупной и распространенной опухоли).

Стадия IV: раковая опухоль распространяется на другие органы за пределами грудной полости.

При центральном раке легкого чаще встречаются плоскоклеточная и мелкоклеточная формы опухоли. Наоборот, аденокарцинома почти в 4 раза чаще наблюдается при периферическом раке.

 

Хирургический метод лечения НМРЛ де-факто остается единственным радикальным методом лечения немелкоклеточного рака легких, при этом его эффективность напрямую зависит от стадии заболевания. К сожалению, у большинства больных рак диагностируется на поздних стадиях, когда процесс уже приобрел распространенную форму, что сужает сферу применения хирургического лечения. В среднем операбельными можно считать приблизительно 20% больных. В остальных 80% случаев целесообразно рассмотреть лучевую и/или химиотерапию.

Лучевая терапия в лечении НМРЛ может быть радикальной и паллиативной. Радикальная лучевая терапия (СОД не менее 60 Гр) применяется как альтернатива хирургическому лечению для больных, которым оперативное вмешательство противопоказано в силу каких-либо причин. Паллиативная лучевая терапия призвана облегчить течение заболевания. При этом в ряде исследований доказывается, что использование лучевой терапии в адъювантных (вспомогательных) целях на ранних стадиях (I и II) не оказывает существенного влияния на выживаемость и безрецидивность.

До недавнего времени использование химиотерапии как метода лечения немелкоклеточной формы рака легкого активно обсуждалось онкологами и было предметом многочисленных дискуссий. Дело в том, что клетки НМРЛ имеют низкую чувствительность к препаратам используемым в химиотерапии (цитостатикам). Ситуация изменилась лишь после начала использования препаратов на основе платины, таких как циспалин и карбоплатин. Само по себе эти препараты имеют не высокую противоопухолевую активность, однако в сочетании с другими цитостатиками способны обеспечить ощутимый клинический эффект. Обычно он выражается в увеличении выживаемости и наступлении частичной ремисси у 25% пациентов с распространенным НМРЛ. На сегодняшний день стандартными схемами химиотерапии считаются следующие комбинации: цисплатина + винорельбин или карбоплатина + паклитаксел.