Безопасность продовольственного сырья и продуктов питания

Яйцо (яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции жидкой сметаны). 10±0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na2SО4, приливают 40 см3 этилацетата и 5 см3 1 н раствора Н2SО4, перемешивают и центрифугируют 5-10 мин при 4000 об/мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 см3 этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 см3 2 % раствора Nа2СО3, насыщенного NаС1 и 10 см3 насыщенного раствора NаСI.

Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 50°С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют  3 см3  смеси  ацетонитрил – вода  1:4  и  экстрагируют  3х5 см3 петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3х5 см3). Этилацетатный экстракт сушат над Na2SО4 (1 г), декантируют, промывают 3 см3 этилацетата сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном испарителе  при  температуре не выше 50°С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл метанола.

Хроматографическое разделение: идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.

Приготовление стандартных растворов. Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см3 и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина – 1 мг/см3. 0,25 см3 полученного раствора помешают в мерную колбу на 25 см3 и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартом растворе 10 нг/мкл.

Хроматографическое  разделение.   На  пластинку  для  тонкослойной хроматографии наносят (рис. 3 а.): в точки 1,3 и 5 соответственно 1,2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.

Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол 10:1. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl2 в НС1, оставляют на 15 мин и опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке, по оттенку и Rf  соответствующих пятнам стандарта, свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно оценивают содержание левомицетина в экстракте.

Подтверждение наличия левомицетина в пробе. Аликвотную часть экстракта (50-100 мкл) упаривают досуха, добавляют 150 мкл 10 % раствора НС1, греют на масляной бане при температуре 98°С в течение 30 мин, отдувая досуха азотом и приливают 200 мкл 2 % метанольного раствора Na2СО3.

На хроматографическую пластинку наносят 1-10 мкл полученной пробы и соответствующее   количество   стандарта   левомицетина   (с   учетом предварительной оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 12:5:4:2.

По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки, ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnСl2 в НСl, оставляют на 15 мин и вновь опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и Rf соответствующих пятнам стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.

Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте. При необходимости точного количественного определения левомицетина в пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек, близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же образом раствор стандарта, так, чтобы количество левомицетина в нем было близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке.  Пластинку  хроматографируют  и  опрыскивают  как  в  п. Хроматографическое разделение. Вырезают зоны левомицетина в опытной пробе, стандарта и соответствующую по Rf и площади зону на пластинке, служащую контролем (рис. 3 б.). Зоны элюируют 3х1 см3 метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5 % раствора SnCl2 в 5 % НСl, греют при температуре 98°С в  течение часа; пробы охлаждают, добавляют по 2 см3 1 % раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 см3 метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с 1=10 мм при λ = 430 нм.

Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:

К - коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из пищевого продукта и равный: 1,33 для мяса; 1,13 - для молока и 1,25 - для яиц; ОПо - оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.; ОПст. - оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.; Р - количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг; V - объем анализируемой пробы, мкл; М - масса образца пищевого продукта, кг (л).   Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5-6,0 мкг. Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20 %. Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

                  а.                                                          линия фронта       б.

                                                                        растворителей

                                                10см

                                                                                                                              I                 II                    III

                 1 см

                                                                        линия старта

1 см            1   2   3   4   5

Рис. 3. Схема нанесения на хроматографическую пластинку стандарта и аликвотных частей экстракта из продукта: а) при визуальной оценке содержания левомицетина в пробе: 1, 3, 5 – точки нанесения 1, 2, 4 мкл раствора стандарта соответственно; 2, 4 – точки нанесения экстракта 3 и 10 мкл соответственно; б) при количественном определении: I, II и III – зоны опытной пробы, стандарта и контроля соответственно.

Лабораторная работа № 6. Обнаружение, идентификация и определение содержания афлаток-синов в продовольственном сырье и продуктах питания с помощью тонкослойной хроматографии.

Афлатоксины являются продуцентами микроскопических грибов Aspergillus flavus и Aparasiticus.      В естественных условиях встречают-ся 4 афлатоксина: афлатоксины В1 и В2 (синяя флуоресценция в длинноволновом УФ свете) и афлатоксины G1 и G2 (сине-зеленая флуоресценция). Среди них высокими токсическими свойствами и наиболее широкой распространенностью выделяется афлатоксин В.

Повсеместная распространенность грибов-продуцентов, их способность поражать продовольственное сырье и пищевые продукты на любом этапе производства, транспортировки или хранения, устойчивость большинства микотоксинов в условиях технологической и кулинарной обработки сырья создают реальные предпосылки для попадания микотоксинов в пищевой рацион человека и обуславливают актуальность проблемы регламентации токсинов в пищевых продуктах.

Содержание афлатоксинов в пищевых продуктах регламентируется Минздравом СССР в соответствии с " Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов" N5061-89 на уровне 5 мкг/кг.

Оборудование и материалы.

Аппарат для встряхивания проб. Ротационный испаритель с ловушкой. Мельница лабораторная электрическая. Облучатель ультрафиолетовый для обнаружения витаминов в растворе. Микрошприцы МШ-10 вместимостью 10мм МШ-25 для жидкостной хроматографии. Насос водоструйный лабораторный. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянный четырехугольный сосуд размером 195х195х200 мм завода "Дружная горка". Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15x15 или 20x20 см, ЧСФР, или подобные. Распылитель стеклянный с грушей. Воронки делительные ВД 2-250 или ВД 2-500. Цилиндры  мерные  с  притертой  пробкой вместимостью 100 см3 и 250 см3. Колбы плоскодонные конические вместимостью   250   или 500 см3 с НШ 29. Колбы круглодонные вместимостью 1000 и 250 см3 с НШ 29. Колбы грушевидные вместимостью 50 и 100 см3 с НШ 14,5. Колбы мерные вместимостью 10,100 и 250 см3. Колонка стеклянная хроматографическая 230х150 мм. Воронки лабораторные. Пипетки с делениями   исполнения 4 или 5 1-го класса точности вместимостью 1см3 или исполнения 6 или 7 вместимостью 10 см3. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100-160 или 100-250 мкм. Ацетон, ч.д.а. Ацетонитрил, ч. Бензол, ч.д.а. Гексан.  Изопропиловый спирт (пропанол-2). Метанол. Спирт этиловый ректификат. Толуол. Хлороформ медицинский или технический.  Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат). Эфир диэтиловый медицинский. Вода дистиллированная.  Кислота азотная.  Кислота лимонная.  Кислота муравьиная. Кислота серная.  Кислота соляная.  Кислота уксусная. Алюминий оксид нейтральный по Брокману 11 для колоночной хроматографии «Rеаnаl», (Венгрия). Алюминий хлористый,6-водный. Бензидин, ч.д.а., раствор в муравьиной кислоте с концентрацией 5г/дм3. Калий хлористый.  Калий железосинеродистый 3-водный, водный раствор с концентрацией 150 г/дм3, (раствор Карреза 1). Цинк уксуснокислый 2-водный , водный раствор с концентрацией г/дм3, (раствор Карреза 2). Калий марганцевокислый, водный раствор с концентрацией 15 г/дм3. Натрия сульфат безводный. Натрий хлористый.  Натрий углекислый кислый (гидрокарбонат). Уголь активированный.  Бумага индикаторная универсальная.   Бумажные фильтры обеззоленные. Стандартные растворы микотоксинов.

Определение афлатоксинов в орехах, зерновых культурах, продуктах переработки хлопка.

Экстракция. Отобранную пробу измельчают в течение 1-2 минут в кофемолке или лабораторной мельнице. Навеску 25 г измельченного продукта помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3 , тщательно перемешивают с 25 см3 10%-го раствора хлористого натрия. Добавляют 100 см3 ацетона и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отбирают 50 см3 фильтрата.

Очистка экстракта.

К 50 см3 фильтрата добавляют 20 см3 15 %-ого раствора ацетата свинца и 30 см3 дистиллированной воды, перемешивают и оставляют стоять на 10 минут в темноте. Отфильтровывают образовавшийся осадок через бумажный складчатый фильтр, отбирают 80 см3 фильтрата. Встряхивают в делительной воронке с гексаном (2х30 см3), каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. Водно-ацетоновый слой экстрагируют хлороформом (1-ый раз 40 см3 хлороформа, 2-ой раз смесью хлороформ-ацетон 3:1 – 30 см3). Объединенные хлороформные экстракты помещают в плоскодонную колбу на 250 см3, для удаления воды добавляют 5-7 г безводного сернокислого натрия. Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в грушевидную колбу, сернокислый натрий промывают 10 мл хлороформа, добавляя смыв к фильтрату. Хлороформный фильтрат упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в 0,4 см3 (400 мкл) смеси бензол-ацетонитрил (97:3)-раствор А и анализируют с помощью одномерной или двумерной ТСХ.

Обнаружение афлатоксинов с помощью одномерной ТСХ.

Пластинку для ТСХ  ("Силуфол") размечают тонкими карандашными линиями в соответствии с рис. 4. На горизонтальной линии, проведенной в 1,5 см от нижнего края пластинки , наносят с помощью микрошприца в 2 см друг от друга 0,002, 0,005 и 0,01 см3 рабочего раствора афлатоксина В1 (2, 5 и 10 нг соответственно) или рабочего раствора смеси афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 .   На расстояние в 1см между пятнами стандартов наносят 0,01 и 0,02 см3 раствора А. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94:4,5:1,5 ) и развивают пластинку до достижения линии, проведенной в 1см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 5 минут и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по хроматографической подвижности и синему цвету флуоресценции пятнам стандартов афлатоксинов, свидетельствует о возможном наличии афлатоксинов в образце.

Тесты, подтверждающие наличие афлатоксинов в пищевом продукте.

Тест № 1.

Для подтверждения наличия афлатоксинов ТСХ-пластинку опрыскивают раствором  азотной кислоты в воде (1:2) и рассматривают ее в длинноволновом УФ-свете. Если цвет флуоресценции стандартов афлатоксинов изменился синего (В , В ) или сине-зеленого (G ,G ) на желтый, а цвет флуоресценции пятен экстракта на желтый не изменился, to афлатоксины в пробе отсутствуют. Если же цвет флуоресценции пятен экстракта также изменился на желтый, то это служит подтверждением возможного наличия афлатоксинов в пищевом продукте.

Тест № 2.

На стеклянную пластинку 20х20 см наливают 5-10%-ый раствор йода в эфире, распределяют его по всей поверхности и дают испариться. Над ТСХ-пластинкой на расстоянии 0,5-1,0 см помещают пластинку с тонким слоем иода и подвергают ее воздействию паров иода в течение 20-30 сек. Затем пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Сохранение цвета и интенсивности флуоресценции пятен стандартов и соответствующих им пятен экстракта подтверждает возможное наличие афлатоксинов в пищевом продукте.

Подтверждение наличия афлатоксинов и количественное определение афлатоксина В1 с помощью двухмерной ТСХ.

Пластинку "Силуфол" размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 5, в правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 0,02 см3 раствора А, в правом верхнем углу наносят 0,005 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов или рабочего раствора афлатоксинов В1. В левом нижнем углу на расстоянии 1,2 и 3 см от левого края и 1,5 см от нижнего края пластинки наносят 0,002, 0,004 и 0,006 см3 рабочего раствора смеси афлатоксинов или афлатоксина В1. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью эфир-метанол-вода (94: 4,5: 1,5) и развивают  пластинку в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 минут, затем развитие пластинки проводят во 2-ом направлении в системе хлороформ-ацетон-вода (90:10:1). После достижения фронтом растворителя карандашной линии ее извлекают, сушат на воздухе и рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Обнаружение афлатоксинов в растворе А  производят аналогично (см. выше). В случае подтверждения наличия афлатоксинов сравнивают интенсивность флуоресценции пятна стандарта В1 с пятном афлатоксина В1 в растворе А и определяют количество вещества в пятне.

Расчет содержания афлатоксина В1 в образце производят по формуле:

где

С – концентрация афлатоксина В1 в образце, мг/кг;

V1 – объем  водно-ацетоновой смеси для экстракции , см3 (125 см3);

V2 – объем водно-ацетонового фильтрата, взятый для анализа, см3 (50 см3);

V3 – объем водно-ацетонового фильтрата и раствор ацетата свинца, см3 (100 см3);

V4 – объем водно-ацетонового фильтрата после очистки ацетатом свинца, см3 (80 см3);

V5 – объем  экстракта  перед  ТСХ  (раствор А)  в см3 (0,4 см3 или 400 мкл);

V6 – объем экстракта (раствор А), наносимый на пластинку, см3 (0,02 см3 или 20мкл);

m – масса афлатоксина В1 в нг в V4 см3 экстракта, оцененная по ТСХ;

М – навеска образца, взятая для анализа, г (25 г).

При приведенных в скобках объемах и навесках формула содержания афлатоксина В1 выражается следующим образом:

С = 0,0025m , мг/кг.