Тканевой активатор плазминогена

Тканевой активатор плазминогена (тромболитический агент)

 

1. Названия и номенклатура МНН

Тканевой активатор плазминогена, тАП, т-АП, тканевой фактор III, т-активатор плазминогена, активатор плазминогена тканевого типа.

Номенклатура  МНН: альтеплаза, ретеплаза.

По номенклатуре ферментов: EC = 3.4.21.68

Название гена: PLAT

Организм-источник: Homo sapiens (Human), reference proteome.

Таксономический определитель: 9606 (NCBI)

ExplorEnz - The Enzyme Database: 

3.4.21.68

IUBMB Enzyme Nomenclature: 

3.4.21.68

ExPASy - ENZYME nomenclature database: 

3.4.21.68

BRENDA, the Enzyme Database: 

3.4.21.68

CAS: 

139639-23-9

 

2. Строение и свойства

2.1. Строение

Тканевой активатор плазминогена (т-АП, альтеплаза, активаза, актилизе, дутеплаза).

Тканевой активатор плазминогена (альтеплаза) – фермент из класса гидролаз, который расщепляет пептидную связь между аминокислотами в белках, конкретно - сериновая протеаза (сериновая эндопептидаза) — фермент, способный разрезать белки рассечением пептидных связей и отличающаяся от других протеаз наличием в своём активном центре аминокислоты серина, представляет собой фосфолипопротеин с молекулярной массой 72 кДа.

Апопротеин этого комплекса  является интегральным мембранным гликопротеином с молекулярной массой около 46 кДа, который прочно ассоциирован с фосфолипидами мембран эндотелиальных, гладкомышечных клеток, моноцитов.

Молекула нативного ТАП состоит из нескольких структурно идентифицируемых областей – доменов, которым присущи различные функции. В молекулу ТАП дикого типа входят: фибронектиновый пальцеобразный домен, существенный для высокоаффинного связывания с фибрином; домен, гомологичный эпидермальному фактору роста, ответственный за рецепторное связывание с клетками печени и ускоренный клиренс; два кренделеподобных домена (крингла) – крингл 1, существенный для связывания с рецепторами эндотелиальных клеток, и крингл 2, ответственный за низкоафифинное связывание с фибрином; а также протеиназный домен, представляющий собой специфичную к плазминогену протеиназу, имеющую в своей последовательности участок связывания ингибитора активатора плазминогена 1 (ИАП-1). Молекулярная масса этого одноцепочечного гликопротеина составляет ~64 кДа. В результате ограниченного протеолиза под действием плазмина или трипсина по связи Arg275-Ile276 одноцепочечный ТАП превращается в двухцепочечную форму. Протеиназный домен образует при этом В-цепь белка, а все остальные домены составляют А-цепь. Указанные цепи удерживаются в структуре биокатализатора дисульфидными связями. В физиологических условиях обе формы ТАП (одноцепочечная и двухцепочечная) со сходной эффективностью активируют превращение плазминогена в плазмин.

Тканевый активатор плазминогена (tPA)

представляет собой полипептид, содержащий

527 аминокислотных остатков (27), молекуляр-

ная масса которого составляет 72 кДа. Молекула

содержит 5 структурных доменов. Вблизи N-

концевой области расположен образующий пет-

лю «пальцеобразный» («finger») домен, за кото-

рым расположен домен фактора роста. За ними

находятся два аналогичных домена «кренделе-

образный» домен 1(«kringle 1») и «кренделеоб-

разный» домен 2 («kringle 2»). Как «пальцеоб-

разный» домен, так и «кренделеобразный» до-

мен 2, специфично связываются с фибриновыми

сгустками, усиливая тем самым активацию свя-

занного плазминогена протеином tPA. Далее по

ходу транскрипции относительно «кренделеоб-

разного» домена 2 расположена сериновая про-

теаза, каталитический сайт которой локализован

на С-конце. Сериновая протеаза ответственна за

превращение плазминогена в плазмин, т.е. за

реакцию, играющую важную роль в гомеостазе

образования фибрина и рассасывания сгустка.

Для правильной складчатости tPA необходимо

правильное спаривание 17 дисульфидных мос-

тиков в молекуле (1)

В структуре белка  Т.ф. различают три домена: основной, расположенный на поверхности клеточной мембраны, трансмембранный и цитоплазматический. Рецепторными функциями обладает поверхностный домен , содержащий 219 аминокислотных остатков Ser- 1-Glu-219. За 23-членным трансмембранным доменом следует цитоплазматический "хвост", с помощью которого происходит закрепление белка на мембране. Здесь реализуется возможность единственного остатка Cys этого домена образовывать тиоэфирную связь с липидами мембраны (пальмитатом или стеаратом). Определенная роль отводится остаткам алифатических аминокислот, с помощью которых белок встраивается во внутренний слой мембраны, усиливая тем самым "заякоривание" молекулы тканевого фактора. Поверхностный домен гликозилирован по трем остаткам треонина (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Он содержит 4 остатка Cys, которые образуют две дисульфидные связи, одну в N-концевой, другую - в С-концевой области домена. Эти связи стабилизируют соответствующие пептидные петли. Показано, что расположенная в С-концевой области дисульфидная связь является функционально значимой, именно ее участие необходимо для проявления кофакторных функций тканевого фактора по отношению к факторам VII и VIIа. На основе анализа первичной структуры, расположения дисульфидных связей и изучения функциональных особенностей, выявлена гомология его с интерферонами Ifn-альфаR иIfn-гаммаR семейства цитокиновых рецепторов класса II.

 

Человеческая t-PA впервые была выделена как одноцепочечная сериновая протеаза с молекулярной массой около 70 000, состоящая из 527 аминокислот с Ser в качестве N-концевой аминокислоты (Рис 3).

Молекула имеет 17 дисульфидных связей и

дополнительное свободное Cys в положении 83. Ограниченная гидролиза

Arg275-Ile276 пептидной  связью по плазмин превращает  Т-PA

для двух цепей молекулы удерживаются вместе одним межцепочечной

дисульфидных связей.ТАП молекула содержит 4 областях: (1)

N-концевой области  из 47 остатков (остатки от 4 до 50;

F-области), которая  является гомологичной с пальцем  область

посредническую  близость фибрина фибронектина; (2) остатки 50

до 87 (E-домен), которые  гомологичны с эпидермальным

фактор роста; (3) 2 крингл регионов (остатки от 87 до 176,

K1-домен, а с  176 по 256, K2-домен), на долю которых

Высокая степень  гомологии с 5 kringles плазминогена,

и (4) области сериновых протеиназ (остатки с 276 по

527, P-домен) при  активном месте остатков His322,

Asp371, и Ser478.

Рис. 3. Структура и аминокислотный состав человеческого ТАП

 

2.2. Свойства

Является сериновой протеазой, которая синтезируется клетками эндотелия человека и присутствует в различных тканях организма.

Участвует в  процессах ремоделирования тканей и миграции клеток.  которая синтезируется преимущественно эндотелиальными клетками сосудов. В кровяное русло ТАП секретируется в виде одно-цепочечной молекулы (молекулярная масса 70 000 Д), которая превращается в двух цепочечную под действием плазмина, трипсина, калликреина или фактора Ха свертывающей системы крови. Уникальным свойством ТАП является его очень высокая избирательность в отношении связанного с фибрином плазминогена, что обеспечивает его преимущественную активацию на поверхности фибринового тромба.

Правда, эта  избирательность в значительной мере утрачивается, когда ТАП используется в терапевтических дозах.

ТАП не обладает антигенными  свойствами и не оказывает существенного  влияния на гемодинамику; пирогенные и аллергические реакции в  ответ на введение ТАП встречаются  редко.

Тканевый активатор плазминогена обладает высоким сродством к  фибрину. Однако он, равно как стрептокиназа и урокиназа, быстро выводится из циркуляции: время полужизни в плазме человека стрептокиназы - 18 мин, урокиназы - 16 мин и тканевого активатора плазминогена - 9 мин. С высокой скоростью клиренса из кровотока этих трех активаторов связана сложность введения их лечебной дозы путем многочасовой инфузии. Длительная обработка пациента системным введением активаторов стимулирует фибринолитическую систему, результатом чего являются опасные кровотечения из-за разрушения фибриногена и предрасположенность пациента к ретромбозам из-за истощения плазминогена.

 

К преимуществам

альтеплазы следует отнести высокую тромболитическую активность, ограниченное

системное влияние на гемостаз, отсутствие антигенных свойств. Малый период

полувыведения (около 5 минут) предполагает поддерживающую инфузию т-АП и

назначение гепарина. Необходимо иметь в виду, что натриевая соль гепарина с

альтеплазой несовместима. Начало эффекта наступает немедленно, а пик

лизирующего действия – через 90 – 120 минут от начала введения. Имеются

сведения, что в роли антидота при развитии геморрагических осложнений может

выступать трасилол, являющийся неспецифическим ингибитором сериновой

протеазы [ ].

 

3. Методы получения, выделения и производства

3.1. Получение

КДНК человеческого ТАП впервые была экспрессирована в E coli. Более эффективная экспрессия была получена в клетках млекопитающих, соблюдая правильный процесс и гликозилирование молекулы. Было показано, что этот рекомбинантный ТАП

(рТАП) неотличим от природного активатора, выделенного из человеческой культуры клеток меланомы, с соблюдением всех биохимических свойств и специфической тромболиточеской активности. Линия клеток яичников китайских хомячков, способная продуцировать одноцепочечный человеческий ТАП, позволила развить крупномасштабную ферментацию клеточной культуры и очистку, получая рТАП в коммерческих целях.

Первоначально для получения tPA в тера-

певтических целях использовали клетки бычьей

меланомы

Синтезируется в виде одной  цепи аминокислот, соединяющиейся с плазминогеном при помощи дисульфидных мостиков.

В последние  годы для клинического применения ТАП  получают ДНК-рекомбинантным методом. В литературе препарат одноцепочечного ТАП, полученного рекомбинантным методом, получил название "альтеплаза" (alteplase), а двухцепочный ТАП — "дутеплаза" (duteplase).

Получают из культуры клеток человека.

 

3.2. Выделение

Первая хорошо очищенная  форма человеческого тканевого  активатора плазминогена была выделена из ткани матки (около 1 мг ТПА из 5 кг ткани).

ТАП выделяют из ткани матки  человека и культуры клеток человеческой меланомы

 

3.3 Производство

После выделения гена,

контролирующего синтез т-АП, стало возможным получать его при помощи

рекомбинантной ДНК-технологии.

Поскольку для клинических це-

лей необходимо иметь стабильный процесс,

обеспечивающий эффективное получение высо-

коочищенного протеина с достаточным выхо-

дом, была создана полноразмерная рекомби-

нантная молекула tPA (r-tPA), экспрессирую-

щаяся в клетках млекопитающих. Клетки яич-

ника китайского хомячка трансфектировали

геном tPA для 8синтеза r-tPA (8, 22). Выведен-

ный из рекомбинантной ДНК продукт, получен-

ный с помощью ферментационной системы с

использованием культур клеток млекопитаю-

щих, собирали и очищали от культуральной

среды.

Альтеплаза выпускается  под патентованными названиями: "активаза" (activase) и "актилиза" (actilyse).

Препарат выпускается в виде

лиофилизированного порошка во флаконах по 20, 50 и 100 мг, к которым

прилагается соответственно 20, 50 и 100 мл растворителя. К

 

4. Механизм биологического действия

На рисунке приведена схема превращений белков крови. На последних стадиях развития сосудистого поражения растворимый белок крови фибриноген под ферментативным действием тромбина превращается в нерастворимый фибрин, составляющий основу для формирования тромба. Наличие тромбов ухудшает или полностью блокирует кровоток и является одной из основных причин весьма распространенных заболеваний сердечно-сосудистой системы. Растворение внутрисосудистых тромбов происходит под действием плазмина. Сериновая протеаза (альтеплаза) катализирует лизис фибрина до образования растворимых продуктов, что способствует восстановлению кровотока.

Схематическое представление взаимодействий белков крови при тромбозе и фибринолизе. Обозначения: Фбг – фибриноген, Фб – фибрин, Тб – тромбин, ПДФ – продукты деградации фибрина, Пмг – плазминоген, Пм – плазмин, АП – активаторы плазминогена: ТАП – тканевой активатор плазминогена, УК – урокиназа, проУК – проурокиназа, Стрк – стрептокиназа. Процессы фибринолиза и развития тромбоза для наглядности обозначены стрелками разного вида.

 

Фибриноспецифические тромболитические препараты

Тканевой активатор  плазминогена (тканевый фактор) сериновая протеаза ( ТАП EC 3.4.21.68) катализирует превращение неактивного профермента плазминогена в активный ферментплазмин и является важным компонентом системы фибринолиза

 

ТАП, определяемый в крови , представляет собой эндотелиальный активатор , высвобождаемый в кровоток под действием разных стимулов. Концентрация ТАП в крови равна 6,6+/-2,9 нг/мл. 

Тканевый фактор - трансмембранный  гликопротеин - член семейства рецепторов цитокинов II класса , может вызывать активацию клеток двумя механизмами.

. Тканевой фактор, инициатор  активации внешнего механизма свертывания крови , локализованный в эндотелиальных и гладкомышечных клетках при их повреждении вступает в контакт с кровью, что в конечном итоге способствует генерации тромбина и запуску механизма свертывания крови. Он обладает высоким сродством к циркулирующему в крови ф.VII . В присутствии ионов Са++ апопротеин Т.ф. образует стехиометрический комплекс с ф.VII, вызывая его конформационные изменения и превращая последний в сериновую протеиназуф.VIIа путем расщепления Arg-152-Ile пептидной связи. Реакция стимулируется следовыми количествами протеиназ, циркулирующих в крови ( ф.Ха , тромбин , ф.VIIа , ф.IXа ). Возникающий комплекс (ф.VIIа-Т.ф.) превращает ф.Х в сериновую протеиназу ф.Ха. Комплекстканевой фактор-фактор VII способен активировать как фактор X, так и фактор IX , что в конечном итоге способствует генерации тромбин а [ Boyle, E.M., Verrier, E.D.,ea., (1996) ].