Микробиология лекарственных средств

Причины развития устойчивости микроорганизмов к антибиотикам многообразны, среди них значимое место занимают нерациональность, а порой и ошибочность применения препаратов:

1. Необоснованное назначение антибактериальных средств.
2. Ошибки в выборе антибактериального препарата.
3. Ошибки в выборе режима дозирования антибактериального препарата.
4. Ошибки комбинированного назначения антибиотиков.
5. Ошибки, связанные с длительностью антибактериальной терапии.

Кроме указанных ошибок назначения антибактериальных препаратов, развитию антибиотикорезистентности  способствует социальная проблема неадекватного доступа к лекарствам, что обусловливает появление на рынке некачественных, но дешевых препаратов, быстрое развитие резистентности к ним и, как следствие, пролонгирование времени болезни.

Устойчивость бактерий к β-лактамным антибиотикам развивается при изменении нормальных пенициллинсвязывающих белков (penicillin-binding proteins - РВР); обретении способности вырабатывать дополнительные РВР с низким сродством к β-лактамам; чрезмерной выработке нормальных РВР (РВР-4 и -5) с более низким сродством к β-лактамным антибиотикам, чем у РВР-1, -2, -3. У грамположительных микроорганизмов цитоплазматическая мембрана относительно порозна и непосредственно прилежит к пептидогликановому матриксу, в связи с чем, цефалоспорины достаточно легко достигают РВР. В противоположность этому наружная мембрана грамотрицательных микроорганизмов имеет существенно более сложную конструкцию: состоит из липидов, полисахаридов и белков, что является препятствием для проникновения цефалоспоринов в периплазматическое пространство микробной клетки.

Снижение сродства РВР  к β-лактамным антибиотикам рассматривают как ведущий механизм формирования резистентности Neisseria gonorrhea и Streptococcus pneumoniae к пенициллину. Метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) продуцируют РВР-2 (РВР-2а), которые характеризуются значительным снижением аффинности к пенициллинарезистентным пенициллинам и цефалоспоринам. Способность этих «новых» РВР-2а к замещению эссенциальных РВР (с более высоким сродством к β-лактамам) в конце концов приводит к формированию устойчивости MRSA ко всем цефалоспоринам.

Безусловно, наиболее клинически значимым механизмом развития устойчивости грамотрицательных бактерий к цефалоспоринам является продукция β-лактамаз.

Не так давно были открыты и так называемые β-лактамазы расширенного спектра действия, кодируемые плазмидами (extended-spectrum beta-lactamases – ESBL). ESBL происходят из ТЕМ-1, ТЕМ-2 или SHV-1 вследствие точечной мутации в активном центре энзимов и продуцируются преимущественно Klebsiella pneumoniae. Продукция ESBL ассоциируется с высоким уровнем резистентности к азтреонаму и цефалоспоринам ІІІ поколения — цефтазидиму и др.

Для микроорганизмов  группы Enterobacter, Serratia, Morganella и др. характерен индуцибельный тип экспрессии. При отсутствии в среде антибиотиков фермент практически не вырабатывается, но после контакта с некоторыми β-лактамами скорость синтеза резко возрастает. При нарушении регуляторных механизмов возможна постоянная гиперпродукция фермента.

В течение некоторого времени после внедрения в практику цефалоспоринов II–III поколений приобретенной устойчивости к ним среди энтеробактерий практически не отмечали. Однако уже в начале 80-х годов появились первые сообщения о штаммах с плазмидной локализацией детерминант устойчивости к этим антибиотикам. Достаточно быстро было установлено, что эта устойчивость связана с продукцией микроорганизмами ферментов, генетически связанных с β-лактамазами широкого спектра (TEM-1 и SHV-1), новые ферменты получили название β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС).

Первым идентифицированным ферментом расширенного спектра  была β-лактамаза ТЕМ-3. К настоящему времени известно около 100 производных фермента ТЕМ-1. Чаще всего бета-лактамазы ТЕМ-типа встречаются среди E.coli и K.pneumoniae, однако их обнаружение возможно практически среди всех представителей Enterobacteriaceae и ряда других грамотрицательных микроорганизмов.

Частота распространения  БЛРС значительно варьирует в  отдельных географических регионах. Так, по данным многоцентрового исследования MYSTIC, в Европе наибольшую частоту распространения БЛРС стабильно отмечают в России и Польше (более 30 % среди всех изученных штаммов энтеробактерий). В отдельных лечебных учреждениях РФ частота продукции БЛРС среди Klebsiella spp. превышает 90 %. В зависимости от специфики лечебного учреждения наиболее распространенными в нем могут быть различные механизмы устойчивости (метициллинрезистентность, устойчивость к фторхинолонам, гиперпродукция хромосомных β-лактамаз и др.).

БЛРС, как уже было сказано, обладают широким спектром активности, в той или иной степени они гидролизуют практически все бета-лактамные антибиотики, за исключением цефамицинов и карбапенемов.

Однако наличие у  микроорганизма детерминанты устойчивости к какому-либо антибиотику далеко не всегда означает клиническую неудачу при лечении этим препаратом. Так, имеются сообщения о высокой эффективности цефалоспоринов III поколения при лечении инфекций, вызванных штаммами, продуцирующими БЛРС.

Антибиотики являются одним  из наиболее значительных открытий ХХ века. Благодаря им стало возможно лечить и вылечивать те заболевания, которые ранее были смертельными (туберкулез, менингит, скарлатина, пневмония). Если человечество не сможет защитить это величайшее достижение медицинской науки, оно вступит в постантибиотическую эру.

Антибиотикорезистентность – естественный биологический процесс. Сейчас мы живем в мире, где антибиотикорезистентность быстро распространяется и растет число жизненнонеобходимых препаратов, которые становятся неэффективными. В настоящее время резистентность микроорганизмов зарегистрирована к антибиотикам, применяемым для лечения менингита, заболеваний, передающихся половым путем, госпитальных инфекций и даже к новому классу антиретровирусных препаратов, применяемых для лечения ВИЧ-инфекции. Во многих странах микобактерии туберкулеза резистентны как минимум к двум среди наиболее эффективных препаратов, применяемых для лечения туберкулеза.

Антибиотикорезистентность — глобальная проблема. Нет страны, которая могла бы позволить себе игнорировать ее, и нет страны, которая могла бы не отвечать на нее. Только одновременно проводимые действия по сдерживанию роста антибиотикорезистентности в каждой отдельной стране смогут дать положительные результаты во всем мире.

 

Методы определения чувствительности к антибиотикам.

 

Методы определения  чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и  методы разведения.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам: диффузионные методы

• с использованием дисков с антибиотиками 

• с помощью Е-тестов

методы разведения

• разведение в жидкой питательной среде (бульоне)

• разведение в агаре 

При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность  агара в чашке Петри наносят  бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 по McFarland) и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35⁰-37⁰ С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах (рис. 1).

 

 

Рис.1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.

 

Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста  проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).

 

 

Рис. 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.

Методы разведения основаны на использовании двойных последовательных разведений концентраций антибиотика  от максимальной к минимальной (например от 128 мкг/мл, 64 мкг/мл, и т.д. до 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл). При этом антибиотик в различных концентрациях вносят в жидкую питательную среду (бульон) или в агар. Затем бактериальную суспензию определенной плотности, соответствующую стандарту мутности 0,5 по MсFarland, помещают в бульон с антибиотиком или на поверхность агара в чашке. После инкубации в течение ночи при температуре 35⁰-37⁰ С проводят учет полученных результатов. Наличие роста микроорганизма в бульоне (помутнение бульона) или на поверхности агара свидетельствует о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность. По мере увеличения концентрации антибиотика рост микроорганизма ухудшается. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост принято считать минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Измеряется МПК в мг/л или мкг/мл (рис. 3).

Минимальная подавляющая  концентрация (МПК) – наименьшая концентрация антибиотика (мг/л или мкг/мл), которая in vitro полностью подавляет видимый рост бактерий.

 

Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде

 

Отдельно хотелось бы остановиться на микробиологической диагностике  легионелл, микоплазм и хламидий.

1. Легионеллезы в настоящее время микробиологически диагностируются с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ) на определение антигена.
2. Первичная атипичная пневмония (микоплазменная) также микробиологически подтверждается с помощью ИФА выявление антител (IgG , IgM).
3. Хламидийные пневмонии диагностируются микробиологически как РИФ, так и ИФА (антигены и антитела (IgG)).

 

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ, ЗАДАЧИ

 

Вариант «j».

 

1. Выбор метода консервации лекарственных средств зависит от:

а) свойств лекарственного средства и цели консервации

б) возможностей предприятия-изготовителя

в) предполагаемых условий  хранения

г) стоимости лекарственного сырья

д) желания потребителя

 

Правильный ответ: а

2. Цель контроля санитарно-бактериологического состояния воздуха в аптеке:

а) профилактика воздушно-капельных  инфекций среди сотрудников

б) предупреждение контаминации лекарственных средств

в) контроль текущей дезинфекции

г) контроль заключительной дезинфекции

д) изучение микрофлоры воздуха

 

Правильный ответ: б

3. В составе нормальной микрофлоры носа доминируют:

а) стрептококки

б) стафилококки

в) энтеробактерии

г) лактобациллы

д) энтеровирусы

 

Правильный ответ: б

 

Задача. При проверке аптеки работниками Роспотребнадзора при исследовании основного сырья, используемого для производства стерильных препаратов, были обнаружены МАФАМ в количестве 250 КОЕ/мл, P. аeruginosa в количестве 19 КОЕ/мл.

• Пригодно ли сырье для использования?

• Назовите возможные источники и причины микробной контаминации.

• Какие мероприятия необходимо провести для выяснения этих причин?
• Следует ли проверять лекарственные средства, изготовленные в асептическом блоке накануне?

 

Требования  к микробиологической чистоте основного сырья для производства стерильных препаратов: не более 100 микроорганизмов в мл при отсутствии Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, S.aureus (ГФ XI, вып.2, стр.187). Данное сырье не соответствует требованиям к микробиологической чистоте и не пригодно для использования. При использовании контаминированного сырья микроорганизмы могут попасть в готовые лекарственные формы.

Инъекционные препараты, глазные капли и мази, препараты  для новорожденных должны быть стерильными. В ряде случаев инъекционные средства, оставаясь стерильными, обладают пирогенными свойствами. Пирогенная реакция организма человека, возникающая за счет применения лекарств, характеризуется повышением температуры, вазомоторными расстройствами, в тяжелых случаях – шоковым состоянием.

Растительное  лекарственное сырье может быть инфицировано изначально, также микробная загрязненность может увеличиваться на всех этапах заготовки, первичной обработки, измельчения, приведения в исходное состояние. Микроорганизмы, населяющие лекарственные растения, можно разделить на две группы: представители нормальной микрофлоры растений; фитопатогенные микроорганизмы – возбудители заболеваний растений.