Методы изучения цитокинов

Название групп рецепторов	Число внеклеточных доменов	Характеристика	Цитокины- лиганды
I. Гемопоэтиновые рецепторы	2-7	4 остатка Cys и наличие последовательности WSXWS	IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, G-CSF и GM-CSF, EPO
II. Рецепторы интерферонов	1-2	4 остатка Cys	IFNa, IFNβ, IFN, IL-10
III. Рецепторы фактора некроза опухоли	1	При взаимодействии с лигандами образуют тример	TNFa , лимфоток- син a
IV. Рецепторы интерлейкина-1	3	Внеклеточные домены суперсемейства иммуноглобулинов, внутриклеточный (TIR) сходен с TIR доменом TLR	IL-1, IL-18
V. Иммуноглобулиноподобные рецепторы	5	Внеклеточные домены — суперсемейства иммуноглобулинов, внутриклеточные — тирозинкиназы	M-CSF, SCF (c-kitL), Flt3L
VI. Рецепторы хемо- кинов	Внеклеточные домены отсутствуют	Родопсиноподобные рецепторы, 7-кратно пронизывающие мембрану. Связаны с G-белком	Хемокины
VII. Другие	Обычно 1	Различные типы структуры	IL-2, IL-15, TGFβ

 

этого рецептора с разным сродством  к IL-2 (низким, промежуточным и высоким) различаются по «степени укомплектованности» полипептидными цепями. Так, отдельно экспрессируемая а-цепь способна связывать IL-2 с низким сродством (Kd=10^-8 М), но не способна передавать сигнал в клетку. Димер βγ обладает промежуточным сродством к IL-2 (Kd=10^-9 M); этот вариант рецептора присутствует на покоящихся клетках и естественных киллерах, причем на последних он передает сигнал. Активированные Т-клетки, а также регуляторные Т-клетки и некоторые естественные киллеры экспрессируют высокоаффинный тримерный рецептор.

Как правило, рецепторы представлены на поверхности покоящихся клеток в небольшом количестве и нередко в неполном субъединичном составе. Обычно в таком состоянии рецепторы обеспечивают адекватный ответ только при действии очень высоких доз цитокинов. При активации клеток число мембранных рецепторов цитокинов увеличивается на порядки, более того, эти рецепторы «доукомплектовываются» полипептидными цепями, как это было показано выше на примере рецептора для IL-2. Под влиянием активации число молекул этого рецептора значительно возрастает и в их составе появляется а-цепь, ген которой экспрессируется в процессе активации. Благодаря таким изменениям лимфоцит приобретает способность пролиферировать в ответ на действие IL-2.

Внутриклеточная передача сигнала при действии цитокинов

В состав С-концевой цитоплазматической части некоторых цитокиновых рецепторов (относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов) входит домен, обладающий активностью тирозинкиназы. Все эти киназы относятся к разряду протоонкогенов, т.е. при изменении генетического окружения становятся онкогенами, обеспечивая бесконтрольную пролиферацию клетки. Эти киназы имеют собственное название. Так, киназу, входящую в состав рецептора M-CSF, обозначают как c-Fms; киназу SCF — c-Kit; известна киназа гемопоэтического фактора — Flt-3 (Fms-like thyro- sine kinase 3). Рецепторы, обладающие собственной киназной активностью, запускают передачу сигнала непосредственно, поскольку их киназа обусловливает фосфорилирование как самого рецептора, так и прилежащих к нему молекул.

Передача сигнала через домен  TIR, общий для рецептора IL-1 и TLR, рассмотрена выше . Сходный путь передачи сигнала от TNF будет рассмотрен далее. Наиболее типичный вариант проявления активности характерен для рецепторов гемопоэтинового (цитокинового) типа, содержащих 4 а-спиральных домена. К цитоплазматической части таких рецепторов примыкают молекулы тирозинкиназ группы Jak-киназ (Janus-associated family kinases). В цитоплазматической части цепей рецепторов есть специальные участки для связывания этих киназ (проксимальный и дистальный боксы). Всего известно 5 Janus-киназ — Jak1, Jak2, Jak3, Tyk1 и Tyk2. Они в различных комбинациях кооперируются с разными цитокиновыми рецепторами, обладая сродством к конкретным полипептидным цепям. Так, киназа Jak3 взаимодействует с у(с)-цепью; при дефектах гена, кодирующего эту киназу, развивается комплекс нарушений в иммунной системе сходный с наблюдаемым при дефектах гена полипептидной цепи рецептора .

При взаимодействии цитокина с рецептором происходит генерация сигнала, приводящего  к формированию транскрипционных факторов и активации генов, определяющих реакцию клетки на действие цитокина. Одновременно происходит поглощение клеткой  комплекса цитокина с рецептором и расщепление его в эндосомах. Сама по себе интернализация этого комплекса к передаче сигнала отношения не имеет. Она необходима для утилизации цитокина, предотвращающей его накопление в месте активации клеток-продуцентов. Большую роль в регуляции этих процессов играет сродство рецептора к цитокину. Только при достаточно высокой степени сродства генерируется сигнал и происходит поглощение комплекса цитокина с рецептором.

Индукция сигнала начинается с  аутокаталитического фосфорилирования связанных с рецептором Jak-киназ, запускаемого конформационными измененями рецептора, которые происходят в результате его взаимодействия с цитокином. Активированные Jak-киназы фосфорилируют цитоплазматические факторы STAT (Signal transducers and activators of transcription), присутствующие в цитоплазме в неактивной мономерной форме.

Фосфорилированные мономеры приобретают сродство друг к другу и димеризуются. Димеры STAT перемещаются в ядро и выступают в качестве транскрипционных факторов, связываясь с промоторными участками генов-мишеней .При действии провоспалительных цитокинов активируются гены молекул адгезии, самих цитокинов, ферментов окислительного метаболизма и др.

Цитокин

 

Экспрессия

гена

  Принципиальная схема передачи сигнала от цитокинов. Показана ключевая роль тирозинкиназ Jak и транскрипционных факторов STAT в передаче сигнала

При действии факторов, вызывающих пролиферацию клеток, происходит индукция генов, ответственных за прохождение клеточного цикла и т.д.

Выделяют 6 разновидностей факторов STAT. В передаче сигналов от разных цитокинов принимают участие разные молекулы STAT. Так, в ответе на цитокины, рецепторы которых содержат γ(с)-цепь, связанную с киназой Jak3, участвуют факторы STAT5а и STAT5b. В передаче сигнала при действии цитокинов семейства IL-6 участвует фактор STAT3, IFNγ — STAT1, IL-12 — STАT4, IL-4 — STAT6 и т.д..

Jak/STAT-опосредованный путь передачи сигналов от цитокинов — основной, но не единственный. С рецептором связаны не только Jak-киназы, но и киназы семейства Src, а также PI₃K.

 Участие Jak-киназ и транскрипционных факторов STAT в передаче сигналов от цитокинов

Цитокины	Jak	STAT
IL-2	Jak1, Jak3	STAT1, STAT3, STAT5
IL-4	Jak1, Jak3	STAT6
IL-3, IL-5, GM-CSF	Jak2	STAT5, STAT6
IL-6, LIF, OSM	Jakl, Jak2, TYK2	STAT1, STAT3, STAT5
IL-7	Jak1, Jak3	STAT5
IL-10	Jakl, TYK2	STAT1, STAT3, STAT5
IL-11	Jakl, Jak2	STAT1, STAT3
IL-12	Jak2, TYK2	STAT4
IL-13	Jak1, TYK2	STAT6
IL-15	Jak1, Jak3	STAT3, STAT5
G-CSF	Jak1, Jak2	STAT3
IFNa, IFNβ	Jak1, TYK2	STAT1, STAT2, STAT3, STAT4
IFN-γ	Jak1, Jak2	STAT1

 

Их активация запускает дополнительные сигнальные пути, приводящие к активации АР-1 и других транскрипционных факторов. Активируемые транскрипционные факторы участвуют не только в передаче сигнала от цитокинов, но и в других сигнальных путях.

Существуют сигнальные пути, участвующие  в контроле биологических эффектов цитокинов. Такие пути связаны с факторами группы SOCS (Suppressors of cytokine signaling), содержащей фактор SIC и 7 факторов SOCS (SOCS-1 — SOCS-7). Включение этих факторов происходит при активации цитокиновых сигнальных путей, что приводит к образованию петли отрицательной обратной связи. Факторы SOCS содержат домен SH2, участвующий в реализации одного из следующих процессов:

• прямого ингибирования Jak-киназ в результате связывания с ними и индукции их дефосфорилирования;
• конкуренции с факторами STAT за связывание с цитоплазматической частью цитокиновых рецепторов;
• ускорения деградации сигнальных белков по убиквитиновому пути.

Выключение генов SOCS приводит к нарушению баланса цитокинов с

преобладанием синтеза IFNγ и сопутствующей этому лимфопенией и усилением апоптоза.

 

 

Особенности функционирования системы цитокинов.

Цитокиновая сеть

Из сказанного выше следует, что  при активации клеток чужеродными  агентами (носителями PAMP при активации миелоидных клеток и антиге-

  Иллюстрация скоординированной индукции выработки цитокинов и экспрессии их рецепторов под влиянием одного и того же индуктора

 

нами при активации лимфоцитов) индуцируется (или усиливается до функционально значимого уровня) как синтез цитокинов, так и экспрессия их рецепторов. Это создает условия для локального проявления эффектов цитокинов. Действительно, если один и тот же фактор активирует и клетки-продуценты цитокинов, и клетки-мишени, создаются оптимальные условия для локального проявления функций этих факторов . Обычно цитокины связываются, подвергаются интернализации и расщеплению клеткой-мишенью, практически не диффундируя от секретируемых клеток-продуцентов. Нередко цитокины бывают трансмембранными молекулами (например, IL-1a и TNFa) или представляются клеткам-мишеням в связанном с пептидогликанами межклеточного матрикса состоянии (IL-7 и ряд других цитокинов), что также способствует локальному характеру их действия.

В норме цитокины если и содержатся в сыворотке крови, то в концентрациях, недостаточных для проявления их биологических эффектов. Однако эти случаи всегда являются проявлением патологии, иногда очень серьезной. По-видимому, локальный характер действия цитокинов имеет для нормального функционирования организма принципиальное значение. Об этом свидетельствует высокая скорость их выведения через почки. Обычно кривая выведения цитокинов состоит из двух компонент — быстрой и медленной. Т_1/2 быстрой компоненты для IL-1β составляет 1,9 мин, для IL-2 — 5 мин (Т₁/₂ медленной составляет 30—120 мин). Свойство близкодействия отличает цитокины от гормонов — дальнодействующих факторов (поэтому утверждение «цитокины — это гормоны иммунной системы» принципиально неверно).

Для системы цитокинов характерна избыточность. Это означает, что практически любую выполняемую конкретным цитокином функцию дублируют другие цитокины. Именно поэтому выключение отдельного цитокина, например, вследствие мутации его гена, не вызывает фатальных последствий для организма. Действительно, мутация гена конкретного цитокина практически никогда не приводит к развитию иммунодефицита. Например, IL-2 известен как фактор роста Т-клеток; при искусственном удалении (путем генетического нокаута) кодирующего его гена существенного нарушения пролиферации Т-клеток не выявляют, однако регистрируют изменения, обусловленные дефицитом регуляторных Т-клеток. Это связано с тем, что пролиферацию Т-клеток в отсутствие IL-2 обеспечивают IL-15, IL-7, IL-4, а также комбинации нескольких цитокинов (IL-1P, IL-6, IL-12, TNFa). Точно так же дефект гена IL4 не приводит к значительным нарушениям в системе В-клеток и переключении изотипов иммуноглобулинов, поскольку сходные эффекты проявляет IL-13. В то же время некоторые цитокины не имеют функциональных аналогов. Наиболее известный пример незаменимого цитокина — IL-7, лимфопоэтическое действие которого, по крайней мере на определенных этапах Т-лимфопоэза уникально, в связи с чем дефекты генов самого IL-7 или его рецептора приводят к развитию тяжелой комбинированной иммунной недостаточности .

Помимо избыточности, в системе  цитокинов проявляется и другая закономерность: цитокины плейотропны (действуют на различные мишени) и полифункциональны (вызывают различные эффекты). Так, число клеток- мишеней IL-1P и TNFa с трудом поддается учету. Столь же разнообразны вызываемые ими эффекты, участвующие в формировании комплексных реакций: воспаления, некоторых этапов гемопоэза, нейротропных и других реакций.

Еще одна важная черта, свойственная системе цитокинов, — взаимосвязь  и взаимодействие цитокинов. С одной  стороны, это взаимодействие заключается в том, что одни цитокины, действуя на фоне индукторов или самостоятельно, вызывают или усиливают (реже подавляют) выработку других цитокинов. Наиболее яркие примеры усиливающего действия — активность провоспалительных цитокинов IL-1β и TNFа, усиливающих собственную выработку и образование других провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8, других хемокинов). IL-12 и IL-18 являются индукторами IFNγ. TGFβ и IL-10, наоборот, подавляют выработку различных цитокинов. IL-6 проявляет ингибирующую активность в отношении провоспалительных цитокинов, а IFNγ и IL-4 взаимно подавляют выработку друг друга и цитокинов соответствующих (Th1 и Th2) групп. Эти взаимоотношения цитокинов будут подробнее рассмотрены при описании субпопуляций Т-хелперных клеток. Взаимодействие между цитокинами проявляется и на функциональном уровне: одни цитокины усиливают или подавляют действие других цитокинов. Описаны синергизм (например, внутри группы провоспалительных цитокинов) и антагонизм цитокинов (например, между Th1- и Th2-цитокинами).

Cуммируя полученные данные, можно заключить, что ни один из цитокинов не существует и не проявляет своей активности изолированно — на всех уровнях цитокины испытывают влияние других представителей этого класса молекул. Результат такого многообразного взаимодействия иногда может быть неожиданным. Так, при использовании в лечебных целях высоких доз IL-2 возникают опасные для жизни побочные эффекты, некоторые из которых (например, шок, подобный токсическому, без бактериемии) удается снять антителами, направленными не против IL-2, а против TNFa. Наличие множественных перекрестных взаимодействий в системе цитокинов послужило причиной создания понятия «цитокиновая сеть», достаточно четко отражающего суть явления.

Для цитокиновой сети характерны следующие свойства:

• индуцибельность синтеза цитокинов и экспрессии их рецепторов;
• локальность действия, обусловленная скоординированной экспрессией цитокинов и их рецепторов под влиянием одного и того же индуктора;
• избыточность, объясняющаяся перекрыванием спектров действия разных цитокинов;
• взаимосвязи и взаимодействие, проявляющиеся на уровне синтеза и реализации функций цитокинов.