Лабораторная диагностика легионеллеза

 

1.Посев на питательные среды  

 

Возбудитель легионеллеза не растет на обычных питательных средах, в том числе очень богатых (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера, триптически-соевый агар, среды на сердечно-мозговом экстракте и др.).

На шоколадном и кровяном агаре возможен слабый рост микроба в первой генерации при массивных посевах культуры.

Выделение возбудителя от больных и из внешней среды  проводят на специальных питательных  средах, применяемых для культивирования  легионелл с обязательным добавлением L-цистеина и растворимого пирофосфата железа. Наибольшее распространение получила угольно-дрожжевая среда. Хорошие результаты получены при замене дрожжевого экстракта насернокислый гидролизат рыбокостной муки. При этом концентрация добавляемого в среду L-цистеина снижается в 2 раза. Для предотвращения пророста посторонней микрофлоры при исследовании контаминированного материала и образцов внешней среды к агару добавляют антибиотики (полимиксин М 40 ед./мл + пенициллин 0,5 мкг/мл + амфотерицин Б 80 мкг/мл).

При подготовке к высеву жидкие образцы разводят 1:10 фосфатным  буфером (pH 7,2). Высевают разведенный и цельный образец в количестве 0,2 мл. При исследовании секционного материала кусочек ткани массой 1 г растирают в стерильной ступке пестиком и готовят 10% суспензию ткани в фосфатном буфере (pH 7,2). Приготовленную суспензию разводят 1:50 тем же буфером и высевают на среды.

Рост колоний из клинического материала наблюдается не ранее  чем через 4 - 5 суток. Максимальное количество вводимых колоний обычно вырастает  на 8 - 10-е сутки. При подозрении на рост легионелл колонии пересевают на ту же среду и на среду, не поддерживающую рост легионелл (контрольную среду). В качестве контрольной среды обычно используют агар Хоттингера или триптически-соевый агар. Рост колоний во втором пассаже на угольно-дрожжевой или рыбокостной среде при отсутствии роста на контрольной среде с большой долей вероятности позволяет заподозрить легионеллез и указывает на необходимость дальнейшей идентификации.

С целью получения культуры возбудителя легионеллеза от биопробных морских свинок рекомендуется производить посев селезенки биопробного животного одновременно на 3 чашки со следующими средами:

1. Угольно-дрожжевой агар.

2. Угольно-дрожжевой агар с антибиотиками.

3. Агар Хоттингера.

Угольно-дрожжевая среда  может быть заменена на рыбокостную среду. При гибели животного от легионеллеза посев должен быть положительным на первых двух чашках. При гибели от другой инфекции рост возбудителя будет отмечаться на 1-й и 3-й чашках и отсутствовать во 2-й.    

Угольно-дрожжевая   среда:   дрожжевой   экстракт   -   10  г,

активированный  уголь  - 2 г, L-цистеин - 0,4 г, пирофосфат железа

растворимый -  0,25  г, K HPO  - 0,85 г, KH PO  - 1,0 г, агар - 17

г, дистиллированная H O - 980 мл.

Все компоненты среды, кроме L-цистеина и пирофосфата железа, добавляют к 980 мл дистиллированной воды, растворяют, доводя до кипения, и автоклавируют 15 минут при температуре 121 °C. Среду охлаждают до 50 °C и добавляют свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4 г в 10 мл дистиллированной воды) и пирофосфата железа (0,25 г в 10 мл дистиллированной воды), профильтрованные через мембранные фильтры (с диаметром пор 0,45 мкн). PH среды доводят до 6,9 при температуре 50 °C добавлением 1 н KOH или 1 н HCl. Среду быстро разливают, слегка взбалтывая для равномерного распределения активированного угля.

Разлитую среду можно  хранить в чашках, помещенных в  пластиковые или металлические  контейнеры, в течение 2 недель.

Рыбокостная среда готовится так же, как и угольно-дрожжевая, за исключением того, что в качестве питательной основы вместо дрожжевого экстракта используется сернокислый гидролизат рыбной кормовой муки - 10 г. Количество цистеина, добавляемого в среду, снижается до 0,2 г. 

 

2. Биологическая проба 

 

 

    Биологическая   проба    является    чувствительным    методом

обнаружения легионелл в исследуемом материале.  Для  биологической

пробы  используют   морских  свинок  весом  250 - 300  г,  которые

заболевают и гибнут от легионеллезной инфекции при внутрибрюшинном

заражении суспензией,  содержащей 10  - 10  клеток бактерий. Через

12 - 48 часов у морских  свинок возникает лихорадочное  заболевание

с подъемом температуры до  39,5  - 41 °C, прострацией и поражением

глаз.  При  массивном  заражении  исследуемого  материала  морские

свинки  гибнут  на  3  -  4-е  сутки; при меньшей инфицированности

материала  гибель  затягивается до 5 - 8 суток. Срок наблюдения за

животными - до 10 дней.

В большинстве случаев  животные погибают от легионеллеза с характерными патологическими изменениями. При вскрытии обнаруживаются перитонит со скудным фибринозным экссудатом, резкая гиперемия париетальной брюшины с инъекцией сосудов. Печень и селезенка увеличены с фибринозным налетом на капсуле. В селезенке встречаются мелкие очаги некроза. Наиболее характерным следует считать развитие пневмонии без резко выраженного инфильтративного воспалительного процесса, некробиоз септальных клеточных элементов, нередко с некрозом альвеолярных перегородок и без поражения крупных сосудов. Характерны также набухание и десквамация мезотелия плевры.

В мазках-отпечатках из селезенки  и легких при окраске по Романовскому - Гимзе обнаруживают, как правило, значительное количество легионелл, а при посеве на угольно-дрожжевой агар десятипроцентной суспензии селезенки морских свинок в 0,05 М фосфатном буфере (pH 7,0) через 48 - 72 часа появляется рост культуры. Если в отпечатках из органов присутствует малое число клеток возбудителя (<= 5 клеток в поле зрения микроскопа), то посев на среды может быть отрицательным. В этом случае рекомендуется ввести 10% суспензию селезенки морских свинок в желточные мешки 5 - 6-дневных куриных эмбрионов в количестве 0,3 - 0,4 мл. Желточные мешки куриных эмбрионов, погибших на 4 - 6-й день после заражения (на 1 - 3-й сутки эмбрионы погибают от посторонней микрофлоры), содержат значительное количество возбудителя (50 - 100 клеток в поле зрения микроскопа), выявляемого окраской по Романовскому - Гимзе или прямой иммунофлюоресценцией.  

 

3. Идентификация возбудителя  

 

Предварительную идентификацию  легионелл осуществляют на основании морфологии и окраски бактерий в мазках по Граму. Легионелла - грамотрицательная палочка длиной 2 - 3 мк (иногда до 10 мк) специфического свечения в реакции прямой иммунофлюоресценции, отсутствует рост на контрольных средах. Окончательная идентификация в настоящее время возможна только в референс-центре НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (с помощью биохимических тестов, газово-жидкостной хроматографии и гибридизации ДНК). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.3. Методы экспресс-диагностики

1. Реакция прямой иммунофлюоресценции  

 

Метод прямой флюоресценции - наиболее распространенный метод  для быстрого определения легионеллезного антигена. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Прямой иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить возбудитель L. pneumophila в отпечатках из свежих и замороженных кусочков легких, в гистологических срезах, плевральном экссудате, мокроте, материале бронхоскопии, а также при идентификации выделенных культур. 

 

Техника приготовления  препаратов 

На предметное стекло наносят  каплю исследуемого материала (или  делают отпечаток органов) и делают тонкий мазок, так как в слишком  густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток. Препарат подсушивают на воздухе при комнатной  температуре и фиксируют в  ацетоне в течение 15 минут. Границу  исследуемого материала, нанесенного  на предметное стекло, отмечают стеклографом с обратной стороны препарата. Препараты  хранят при температуре +4 °C до обработки  люминесцирующей сывороткой. 

 

Техника постановки реакции 

На поверхность фиксированного и высушенного мазка, помещенного  во влажную камеру (чашка Петри  с кусочком смоченной в воде фильтровальной бумаги), наносят каплю рабочего разведения легионеллезной люминесцирующей сыворотки. Окраску препарата производят 20 минут при температуре 37 °C. Затем мазки промывают 10 - 15 минут в фосфатном буфере, pH 7,2, дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят глицериновую среду, покрывают покровным стеклом и просматривают в люминесцентном микроскопе.

Рабочее разведение люминесцирующей  сыворотки рекомендуется готовить по мере надобности. 

 

Учет и  оценка результатов 

Мазки микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа. Для микроскопа используют иммерсионный объектив 90 x (1,25) и окуляры 5 x 7 и нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Для получения яркого свечения бактерий необходимо тщательно центрировать осветительную систему микроскопа и подбирать соответствующие светофильтры. Наличие в препарате клеток бактерий следует контролировать с помощью фазово-контрастного устройства.

В положительных случаях  после обработки данного препарата  специфической легионеллезной люминесцирующей сывороткой в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое изумрудно-зеленое свечение легионеллезных бактерий.

Степень яркости люминесценции  бактерий, "окрашенных" люминесцирующими антителами, принято обозначать в  крестах. Специфическим считается  свечение с яркостью "++++" и "+++", свечение с яркостью "++" и "+" принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося ореола хотя бы у 3 - 5 клеток в каждом поле зрения свидетельствует о наличии в  исследуемом материале бактерий.

Отрицательный результат  свидетельствует об отсутствии микроорганизма или о содержании в исследуемом  материале в низкой концентрации, не выявляемой иммунофлюоресцентным методом при прямом исследовании без подращивания или обогащения.

При исследовании различных  препаратов необходимо иметь в качестве контроля мазок, приготовленный из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий, обработанный люминесцирующей сывороткой.

Несмотря на то, что рабочее  разведение сыворотки указано на этикетке ампулы, для каждой сыворотки  его следует устанавливать опытным  путем, так как оно может меняться в зависимости от конкретных условий микроскопирования препаратов.

С этой целью в ряде пробирок делают кратные (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) разведения люминесцирующей сыворотки, используя  при этом физиологический раствор, pH 7,2. Каждым разведением сыворотки обрабатывают заранее приготовленный, фиксированный и подсушенный препарат с мазком из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий. Дальнейшая обработка препаратов идет по ранее описанной (для прямого варианта РИФ) методике. Рабочим разведением сыворотки считается то наибольшее разведение, при котором выявляется специфическое сверкающее зелено-желтое свечение бактериальной клетки на темном фоне препарата. 

 

2. Реакция иммуноферментного  анализа (ИФА)

для определения легионеллезного антигена 

 

Реакция иммуноферментного  анализа (ИФА) позволяет определить легионеллезный антиген в клиническом материале (моча, мокрота, бронхиальные смывы) при экспериментальных и клинических исследованиях. 

 

Техника приготовления  препаратов 

В   лунки   полистироловых   планшетов   вносят   по  100  мкл

легионеллезных  иммуноглобулинов  в  концентрации 20 - 30 мкг/мл в

карбонат-бикарбонатном  буфере  (КББ), pH 9,5. Планшеты инкубируют

при температуре 37 °C в течение 2 часов или в течение 18 часов при

температуре  4  °C.  Затем  планшеты  трижды  отмывают ФСБ с 0,05%

твина-20,   просушивают.  В  лунки  сенсибилизированных  планшетов

вносят  разведения  исследуемого материала (антигена) в объеме 100

мкл. Разведения антигена делают на ФСБ с 0,05% твина-20. Инкубация

1  час  при температуре 37 °C. Затем планшеты трижды отмывают по 5

минут  ФСБ  с  0,05%  твина-20.  В  лунки отмытого планшета вносят

конъюгат  (легионеллезные  иммуноглобулины с ферментом пероксидазы

хрена).  Конъюгат  разводят  тем  же  буфером с твином-20 (рабочее

разведение   конъюгата   указано  на  этикетке).  После  1-часовой

инкубации  при температуре 37 °C лунки планшета тщательно отмывают

от непрореагировавшего конъюгата. Затем в лунки планшета вносят по

100   мкл  свежеприготовленного  субстрат-индикаторного  раствора,

содержащего  0,04%  О-фенилен-диамина  в  0,1 М цитратно-фосфатном

буфере, pH  6,0,  в присутствии 0,006% H O . Инкубируют 30 минут в

темноте  при  комнатной  температуре. Реакцию останавливают равным

объемом 1 н раствора серной кислоты. 

 

Учет результатов  

Реакцию учитывают визуально  или фотометрически по изменению окраски субстрата в опытных лунках. Появление желто-оранжевого окрашивания в лунках с антигенсодержащими пробами при его отсутствии в контрольных отрицательных пробах свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов при 492 нм проба считается положительной, если ОП опыта в 2 раза и более превышает ОП контроля. В качестве отрицательных контролей обязательны контроль субстрата и контроль сорбции конъюгата.