Лабораторная диагностика легионеллеза

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

 

Введение………………………………………………………..……………3

Глава 1. Возможная клиника…………………….…………..…………….4

Глава 2. Лабораторная диагностика  легионеллеза………...……………….6

2.1 Серологические методы  диагностики………………..…………………6

2.2 Бактериологические методы……………………………..……..………11

2.3. Методы экспресс-диагностики………………………….……………..16

Заключение………………………………………………………….……….20

Список использованных источников………………………………………21

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

          Интерес к этим микроорганизмам возник в связи со вспышкой  неизвестной инфекции в Филадельфии во время съезда ветеранской организации Американский Легион (1976). Всего заболел 221 человек, а скончалось – 34 человека. Заболевание получило название «болезнь легионеров». В 1977 г. Дж. Мак-Дейд  и С. Шепард выделили неизвестную грамотрицательную палочку, которая в классификации была отнесена к новому роду Legionella к семейству Legionellaceae в отделе Cracilicutes. В дальнейшем была установлена роль легионелл в многочисленных эпидемических и эндемических вспышках в различных регионах, включая РФ. Среди бактерий этого рода выделены новые виды, патогенные для человека; вызываемые ими поражения были объединены под общим названием «легионеллезы».  Легионеллез представляет собой тяжелое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией, поражением дыхательной, мочевыделительной и центральной нервной системы. [Поздеев О.К. – Медицинская микробиология/2001.-400с.]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 1. Возможная  клиника

          Для диагностики легионеллеза необходимо знать возможные клинические формы заболевания.

          Инкубационный период разнится в зависимости от клинической формы инфекции, в целом может составлять от 2 до 10 дней. Его средняя продолжительность – 4-7 дней.

          В большинстве случаев легионеллез протекает в виде тяжелой пневмонии (именно ее называют «болезнью легионеров»). У некоторых больных отмечается продромальный период – имеет место головная боль, слабость, ухудшение аппетита, иногда диарея. В остальных случаях заболевание начинается остро, с резкого подъема температуры тела до высоких цифр и нарастания интоксикации (озноб, головные боли, миалгии и артралгии, потливость). Вскоре интоксикация затрагивает ЦНС, отмечается заторможенность, эмоциональная неустойчивость, бред, галлюцинации, обмороки, нарушение сознания. Могут отмечаться нейродисфункции – параличи глазодвигательной мускулатуры. На 3-4 день заболевания обнаруживается кашель, первоначально сухой, в последующем - с отделением скудной слизисто-гнойной (иногда кровянистой) мокроты. Заболевание протекает тяжело, лечению поддается плохо. Часто осложняется экссудативными плевритами, абсцессами, способствует развитию инфекционно-токсического шока.

          Сердечно-сосудистые нарушения являются следствием тяжелой интоксикации и общей гипоксии ввиду развивающейся дыхательной недостаточности. У больных отмечается артериальная гипотензия, нарушения ритма (брадикардия сменяется тахикардией). У трети больных инфекция сопровождается симптоматикой со стороны пищеварительной системы: диарея, боли в животе, желтуха (сопровождается соответствующими изменениями в биохимическом анализе крови). Нарушения мочевыделительной функции вплоть до острой почечной недостаточности могут оставаться в виде последствий несколько месяцев.

Астенический синдром (слабость, повышенная утомляемость, ухудшение памяти) после перенесения инфекции может сохраняться несколько недель.

Легионеллез может протекать в виде острого альвеолита. Заболевание также начинается с нарастающей интоксикации и лихорадки, сухой кашель присутствует с первых дней, в дальнейшем становясь влажным, прогрессирует одышка. Альвеолы пропотевают фибрином и эритроцитами, перегородки становятся отечны. В случаях затяжного прогрессирующего течения альвеолита нередко формируются очаги фиброза легких.

          Еще одна из форм легионеллеза – лихорадка Понтиак. При этом инфекция протекает в виде острого респираторного заболевания. Интоксикация не менее тяжелая, чем при других формах, лихорадка достигает 40 °С, сопровождается ринитом, воспалением верхних дыхательных путей. Часто сопровождается рвотой и болью в животе, расстройствами центральной нервной деятельности (бессонница, головокружения, нарушения сознания и координации). При этой форме продолжительность периода основных клинических проявлений обычно не превышает нескольких дней, течение инфекции доброкачественное.                   Иногда легионеллез протекает в виде острой лихорадки (лихорадка Форта Брегг), сопровождающейся высыпаниями разнообразного характера. [Коротяев А.И. – Медицинская микробиология/2008.-519с.]

В исключительных случаях встречаются  иные формы легионеллеза (генерализованная, септическая, полиорганная).

 

 

 

 

Глава 2. Лабораторная диагностика легионеллеза

 

 

 В настоящее время используют три  основные группы методов лабораторной диагностики:

1. Серологические методы.

        2. Бактериологические методы. [Поздеев О.К. – Медицинская микробиология 2001.-401с.]

       3. Экспресс-методы обнаружения возбудителя и его антигенов.

 

 

2.1 Серологические методы диагностики

1. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РИФ)

 

Техника постановки  

На  чистое  обезжиренное предметное стекло наносят 3 отдельных

небольших  капли  легионеллезного  антигена,  в  качестве которого

используют  убитую  кипячением 2-суточную культуру L. pneumophila,

выращенную  на  угольно-дрожжевом агаре, содержащем L-цистеин (0,4

г/л)  и  пирофосфат  железа, растворимый (0,25 г/л) в атмосфере 5%

CO .   В  работе  используют  антиген  L.  pneumophila  из  штамма

Philadelphia  I.  в  рабочем разведении (40 бактериальных клеток в

поле  зрения  в  фазоконтрастном  микроскопе).  После подсушивания

антигена  на  воздухе в течение 10 - 15 минут препарат фиксируют в

ацетоне  15  минут  и  снова  подсушивают в течение 2 - 3 минут на

воздухе   при  комнатной  температуре.  После  фиксации  препарата

антиген  на  стороне  мазков  следует  обвести стеклографом, что в

дальнейшем  препятствует  слиянию  капель  сыворотки  в  различных

разведениях.  Стекла с антигеном помещают во влажную камеру (чашка

Петри  с увлажненной фильтровальной бумагой на дне)  и препараты с

антигеном  обрабатывают  сывороткой  больных  в  разведениях 1:32,

1:64,  1:128.  Первое  разведение  сыворотки  1:8  делают  в  0,5%

растворе  яичного  желтка  в  забуференном физрастворе (pH = 7,2),

последующие    двукратные    разведения   сыворотки   проводят   в

забуференном   физрастворе.   Препарат   антигена   с   сывороткой

инкубируют 30 минут при  температуре 37 °C во влажной камере, после

чего  промывают  5  -  10 минут фосфатным буфером (ФСБ), pH = 7,2,

дистиллированной  водой  и  высушивают  на воздухе. Далее препарат

обрабатывают    люминесцирующей   сывороткой   против   глобулинов

человека,  взятой  в  рабочем  разведении. Инкубируют 30 минут при

температуре 37 °C во влажной  камере, промывают 5 - 10 минут в ФСБ,

pH  =  7,2,  споласкивают  дистиллированной  водой,  высушивают на

воздухе и наносят среду с глицерином, покрывают покровным стеклом.

Такой  препарат  готов  для просмотра в люминесцентном микроскопе.

При  постановке  реакции  иммунофлюоресценции   необходимо  делать

положительный   контроль   (антиген   с   положительной  кроличьей

легионеллезной  сывороткой)  и  отрицательный  контроль (антиген с

нормальной сывороткой). 

 

Учет и  оценка реакции 

Препарат микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа. Для микроскопии используют иммерсионный объектив 90 x (1,25) и окуляр 5 x 7 и нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

В положительных случаях, то есть когда исследуемая сыворотка  содержит специфические антитела, после  обработки данного препарата  люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека выявляется специфическое  яркое зелено-желтое свечение бактерий на темном фоне препарата. При специфической  флюоресценции удается обнаружить более яркое свечение по периферии  бактериальной клетки и более  слабое в ее центральной части. Для  оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему: ++++ - яркие сверкающие изумрудно-зеленые клетки, люминесцирующие по периферии, четко контрастирующие с темным телом клетки; +++ - умеренная изумрудно-зеленая люминесценция по периферии клетки; ++ - зеленое свечение всей клетки; + - едва заметная зеленая люминесценция всей клетки. Положительным результатом считают флюоресценцию, оцениваемую на "++++" и "+++". За титр исследуемой сыворотки принимают последнее разведение, которое обеспечивает бактериальной клетке специфическое свечение, оцениваемое на "++++" и "+++". Разведение сыворотки, при котором отмечается слабое свечение бактериальной клетки, оцениваемое на "++" и "+", не учитывают.

Положительный контроль (препарат антигена с положительной кроличьей  легионеллезной сывороткой) должен давать яркое специфическое свечение легионелл, в отрицательном контроле (препарат легионеллезного антигена с нормальной кроличьей сывороткой) свечение отсутствует полностью.

Большинство больных легионеллезом имеет выраженную сероконверсию с нарастанием титров антител в 4 - 128 раз в сыворотках реконвалесцентов по сравнению с первой сывороткой, полученной в острый период заболевания. В случаях, когда проанализировать динамику изменения не представляется возможным, диагноз ставится по высокому уровню специфических антител (титр не менее 1:64). Появление специфических антител у отдельных больных может происходить уже к 6 - 7-му дню от начала заболевания. Титры быстро возрастают на 2 - 3-й неделе, достигая максимальных значений к 5-й неделе от начала заболевания. В последующие месяцы титры уменьшаются. Необходимо учитывать возможность выявления перекрестных реакций сыворотки больных легионеллезом в РИФ с антигенами пситтакоза и лихорадки КУ. Однако титр антител в реакции с гомологичной культурой обычно бывает выше, чем с гетерологичной, что является основой для дифференциальной диагностики. 

 

2. Реакция иммуноферментного  анализа (ИФА) 

 

Техника постановки реакции 

В лунки полистиролового планшета вносят по 100 мкл растворимого антигена L. pneumophila в концентрации 1 - 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH = 7,2. Планшеты инкубируют при температуре 37 °C в течение 2 часов или в течение 18 часов при температуре +4 °C. Затем планшеты трижды отмывают в ФСБ с 0,05% твина-20 и просушивают. В лунки сенсибилизированных планшетов вносят последовательно двукратные разведения исследуемых сывороток (или крови) в объеме 100 мкл. Разведения сывороток делают на ФСБ с 0,05% твина-20. Начальное разведение сывороток 1:100. Инкубация 1 час при температуре 37 °C. Затем планшеты трижды отмывают по 5 минут ФСБ с 0,05% твина-20.    

В лунки отмытого планшета вносят конъюгат в рабочем разведении

в   объеме   100  мкл  (кроличьи  иммуноглобулины  к  сывороточным

глобулинам  человека,  меченные  пероксидазой  хрена, производства

НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР). Конъюгат разводят тем же буфером

с твином-20. После 1-часовой  инкубации при температуре 37 °C лунки

планшета  тщательно  отмывают  от  непрореагировавшего  конъюгата.

Затем  в  лунки  планшета  вносят  по 100 мкл свежеприготовленного

субстрат-индикаторного       раствора,      содержащего      0,04%

О-фенилендиамина в 0,1  М  цитратно-фосфатном  буфере, pH = 6,0, в

присутствии  0,006%  H O .  Инкубируют  30  минут  в  темноте  при

комнатной  температуре.  Реакцию  останавливают равным объемом 1 н

раствора серной кислоты.  

 

Учет результатов  

Интенсивность окрашивания  определяют визуально или спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Результаты исследования считают положительными, если титр исследованной сыворотки превосходит титр отрицательного контроля более чем на 2 разведения при визуальном учете результатов реакции или оптическая плотность (ОП) исследованной сыворотки более чем в 2 раза превышает показания ОП отрицательного контроля при фотометрическом учете.

За положительные результаты принимают наличие антител к L. pneumophila в титрах 1:400 и выше. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2 Бактериологические методы 

 

Возбудитель редко удается  выделить от больного. Для исследования берут материал бронхоскопии, плевральную  жидкость, легочный экссудат. Описаны  единичные случаи выделения возбудителя  из мокроты, крови. Значительно чаще выделяют возбудитель из секционного  материала (легочной ткани). При бактериологическом исследовании на легионеллез применяют посев на специальные питательные среды и биологическую пробу на чувствительных животных.