Иммуноцитохимическая диагностика мужских половых клеток

 

• Приготовить парафиновые срезы на стеклах, покрытых поли-L-лизином, провести депарафинирование и регидратацию в TBS (Dako TBS, S196830, добавить 0,05% Tween 20).
• Удалить избыток жидкости вокруг срезов и капнуть 1% р-р перекиси водорода 10 мин.
• Промыть в TBS.
• Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
• Нанести первичные антитела (мышиные или кроличьи). Инкубировать 30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
• Промыть в TBS.
• Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
• Нанести вторичные антитела (смесь антимышиных или антикроличьих биотинилированных антител). Инкубировать 15-30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
• Промыть в TBS.
• Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
• Нанести конъюгированный с пероксидазой стрептавидин. Инкубировать 15-30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
• Промыть в TBS.
• Удалить избыток жидкости вокруг срезов.
• Провести гистохимическое выявление пероксидазной активности с раствором диаминобензидина 5-10 мин.
• Промыть в воде.
• Докрасить ядра гематоксилином Майера 1-2 мин.
• Промыть срезы в проточной воде.
• Провести дегидратацию в восходящей батареи спиртов.
• Заключить срезы в канадский бальзам.

 

Оценка результата иммуногистохимической реакции

 

Для выявления образовавшегося  в процессе реакции комплекса «антиген – антитело», используют различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител: ферменты, флуорохромы, биотин, металлы.

В настоящее время  в качестве окрашенных меток широко используются пероксидаза хрена  и щелочная фосфатаза. Окисление  пероксидазы хрена с помощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции коричневую окраску, в то время как щелочная фосфатаза после взаимодействия с различными субстратами (AS-MX фосфат, 5-бром-4-хлоро-3-индоксил фосфат и др.) формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от используемого красителя можно окрасить в синий (прочный синий ВВ) или красный (прочный красный TR) цвет.

При использовании различных  методов визуализации антигенов  должно получиться интенсивное четко  выявляемое окрашивание тканевых антигенов  в исследуемом образце и позитивном контроле. Окрашивание негативного  контроля также необходимо принимать во внимание при оценке специфичного расположения исследуемых антигенов. Интерпретация полученных результатов ИГХ реакции включает такие термины, как "выраженная позитивная реакция", "ложно-позитивная реакция", "негативная реакция", "ложно-негативное окрашивание".

Негативную реакцию  сложно интерпретировать, в отличие  от позитивной, для этого необходимо провести контрольные исследования с различными дополнительными антителами.

Контроль иммуногистохимической  реакции:

Контроль ИГХ реакции  означает оценку специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами. С этой целью используют отрицательный и положительный контроль.

 

Отрицательный контроль.

• Берут срезы тканей, в которых заведомо нет искомого антигена. Результаты реакции должны быть отрицательными.
• При проведении ИГХ реакции исключают инкубацию с первичными антителами, заменяя их неиммунной сывороткой. Результаты реакции должны быть отрицательными.
• Антитела (в максимальном разведении) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1-10 нмоль/ мл), затем их наносят на срезы в качестве контроля. Результаты реакции должны быть отрицательными. После адсорбции специфическим антигеном антитела должны терять способность окрашивать ткань. Подобный контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых участков взаимодействия антител с тканью.

 

Положительный контроль.

 В качестве положительного  контроля служат срезы тканей, в которых исследуемый антиген  заведомо присутствует. Результаты  реакции должны быть положительными [4].

 

 

 

Иммуноцитохимическая диагностика мужских половых клеток

 

Сперматогенез является одним из важнейших биологических  процессов, так как связан с передачей  генов следующему поколению. Основу сперматогенеза составляют сперматогониальные стволовые клетки (ССК), присутствующие в небольшом количестве в тестисе взрослого индивидуума. Высокоспецифичным поверхностным маркером ССК является белок межклеточной адгезии Е-кадхерин [5].

Е-кадхерин (увоморулин) принадлежит семейству трансмембранных  кальций-зависимых гликопротеинов, обеспечивающих адгезивные межклеточные контакты клеток. Повреждение Е-кадхерина приводит к дестабилизации связей между клетками. ИГХ исследование проводили ПАП-методом на парафиновых срезах толщиной 5 мкм по стандартному протоколу. Использовали моноклональные антитела к  Е-кадхерину (Novocastra). Инкубация с первичными антителами проводилась после предварительной обработки срезов в микроволновом (2х5 мин) режиме при мощности 650 Ватт. На следующих этапах применяли KIT фирмы DAKO (Envision, Mouse/Rabbit); в качестве хромогена использовали диаминобензидин – ДАВ+ (DAKO), ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.  
Экспрессию соответствующих маркеров оценивали как число позитивно окрашенных клеток на 100 учтенных в репрезентативных полях зрения при увеличении х400 выраженное в %. ИГХ реакцию считали положительной при окрашивании >5%  клеток [3].

При  исследовании структур  семенника было отмечено, что наиболее интенсивно маркируются  сперматогонии. Выраженность маркирования сперматоцитов и сперматид вариабельна, что, вероятно связано со стадией их мейоза. Клетки Лейдига маркируются положительно только вблизи отрезка семенного канальца с наибольшей активностью экспрессии васкулярно-эндотелиального фактора роста . Сустентоциты не маркируются. Клетки стромальной ткани и миоидные клетки также иммунонегативны. Интенсивность реакции кровеносных сосудов зависит от их топографии. Согласно полученным данным можно сделать заключение: имеет место активная экспрессия васкулярно-эндотелиального фактора роста клеточными элементами сперматогенеза при параллельной активности клеток Лейдига. ВЭФР в семеннике способствует оптимальной васкуляризации регионов микроокружения эпителиосперматогенного пласта [2].

В настоящее  время известно несколько ядерных  и мембранных антигенов, изменение экспрессии которых связано с пролиферативной активностью клеток. Одним из наиболее изученных молекулярных биомаркеров является показатель пролиферативной активности Ki 67, антитела к антигену которого реагируют с пролиферирующими клетками, находящимися в G1, S, M, G2 стадиях клеточного цикла. Если клетка не пролиферирует, такого взаимодействия не происходит [6]. Индекс мечения Антителом к Ki-67 - надежный прогностический маркер для многочисленных неоплазий, включая астроцитомы 2 степени, олигодендроглиому, карциномы толстого кишечника и молочной железы [7].

Образцы фиксировали в нейтральном забуференном формалине и после обычной проводки заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимическое выявление антигена Ki-67 с помощью моноклональных антител (фирма «DAKO», Дания) после термической обработки в скороварке для восстановления антигенной реактивности и применением вторичного комплекса En Vision (фирма «DAKO»). Положительным результатом иммуногистохимической реакции являлось наличие специфического окрашивания ядер клеток при выявлении антигена Ki-67. Подсчет индекса Ki-67 проводили с помощью светового микроскопа  при анализе 1000 клеток с использованием иммерсионного объектива. Индекс Ki-67вычисляли как отношение клеток, экспрессирующих эти антигены, к общему количеству подсчитанных клеток, выраженное в процентах. [6].

Молекулярным маркером апоптоза является показатель Bcl-2. Bcl-2 (B cell lymphoma/leukemia-2) гены локализованы на 18 хромосоме и играют важную роль в определении, будет ли клетка необратимо подвержена апоптозу. Известно, что Bcl-2 – только один член этого семейства, состоящего из многочисленных белков, гомологов Bcl-2. Другие члены bcl-2 семейства генов, вероятно, играют важную роль в регулировании апоптоза при помощи механизмов, которые являются противоположными или комплиментарными действию Bcl-2. Члены данного семейства взаимодействуют через гомодимерные или гетеродимерные ассоциации так, что восприимчивость клеток к потенциальному апоптотическому стимулу может быть определена степенью проапоптотических и антиапоптотических воздействий представителей этой группы белков, находящихся в клетке в данное время. Проапоптозный белок Bax является членом Bcl-2 семейства. Он увеличивает восприимчивость клеток к клеточной смерти, возможно, противодействуя эффекту антиапоптозного белка Bcl-2 на клеточное выживание путем гетеродимерного взаимодействия. Белки Bcl-2 и Bax формируют гомодимеры либо гетородимеры. Bax-Bax гомодимеры индуцируют апоптоз, гетеродимеры Bcl-2-Bax препятствуют процессам апоптоза как в нормальных, так и в патологических тканях. Другой член этого семейства генов, bcl-x, представляет интересный пример одиночного гена, который через альтернативные связанные механизмы кодирует положительную и отрицательную регуляцию апоптоза. Длинная форма Bcl-X - Bcl-X_long состоит из 233 аминокислот с двумя гомологичными доменами к Bcl-2, тогда как Bcl-X_short (170 аминокислот) – усеченная форма Bcl-X_long, в которой участок высоко гомологичный Bcl-2 удален. Эти две формы Bcl-X имеют противоположное действие, в котором Bcl-X_long придает клеткам устойчивость к апоптозу, тогда как Bcl-X_short противодействует сопротивлению к апоптотической клеточной смерти, обеспечиваемой Bcl-2.

Для оценки апоптоза был использован новый фактор дифференцировки клеток HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor), который первоначально был выделен из среды культивирования промиелоцитарного лейкоза человека HL-60, обработанных полностью-транс-ретиноевой кислотой. Данный фактор представляет собой небольшой гликозилированный белок с молекулярной массой 8.2 кДа, индуцирующий дифференцировку исходных активно пролиферирующих клеток HL-60 по гранулоцитарному пути (Костанян И.А. и др., 1994).  HLDF играет важную роль в процессе апоптоза, поскольку как сам фактор HLDF, так и его ДНК-гидролизующий фрагмент, принимают участие в процессах запрограммированной гибели клеток. Скорее всего, зрелый фактор дифференцировки (и его предшественник) непосредственно участвуют во фрагментации ДНК в клетках миелоидного ряда с запущенным процессом программированной гибели. Направления развития метаболизма – апоптоз, или дифференцировка – зависят от физиологического состояния клетки. Были получены поликлональные антитела против фактора дифференцировки HLDF. Специфичность связывания антител подтверждалась иммуноблоттингом с синтезированным пептидом HLDF. Иммуногистохимическое окрашивание клеток HL-60 с помощью поликлональных антител против HLDF показало, что только в дифференцированных под воздействием ретиноевой кислоты или введенных в апоптоз обработкой церамидом C2-Cer (N-ацетил сфингозин) в течение суток клетках, наблюдается специфическое точечное окрашивание ядер и цитоплазматической мембраны. При этом более интенсивное окрашивание наблюдается в апоптотических клетках [1].

Экспресс-тест для обнаружения следов спермы человека «Seratec PSA Semiquant»

Тест SERATEC PSA SEMIQUANT ─ иммунохроматографический экспресс-тест, подтверждающий наличие простатического специфического антигена (ПСА) в пробе. Поскольку данный антиген в больших  количествах  содержится  в  семенной  жидкости,  тест  может быть  использован  при  проведении судебно-биологической экспертизы для  определения  следов  спермы.  Положительный  результат наступает при появлении полосы результата, легко определяемой визуальным способом.  Для  полуколичественной  оценки  концентрации  ПСА возможно сравнение цветовой интенсивности полосы результата с интенсивностью полосы внутреннего стандарта (4 нг/мл). 

ПРИНЦИП ТЕСТА      

 Тест SERATEC PSA Semiquant – иммунохроматографический экспресс-тест (Chromatographic Immunoassay, CIA). Действующими составляющими  теста  являются  два моноклональных мышиных антитела против ПСА. Одно из антител нанесено на мембрану в области результата.  Область  контроля  и  область  внутреннего  стандарта содержат фиксированные козьи поликлональные противомышиные антитела,  причём  их  количество  в  области  внутреннего  стандарта выбрано таким образом, что интенсивность окраски линии внутреннего стандарта будет соответствовать концентрации ПСА 4 нг/мл. Перед мембраной   находится   стекловолоконная   подушечка,   впитывающая нанесённую пробу. Она направляет пробную жидкость к волоконной области,  на  которую  нанесено  второе  моноклональное  мышиное антитело против ПСА, маркированное коллоидом золота. Это антитело также связывает ПСА. 
       После нанесения пробы, содержимое пробы продвигается по мембране к указанным областям контроля, внутреннего стандарта и результата. Независимо от присутствия ПСА в пробе антитела, маркированные коллоидом золота, образуют комплексные соединения с противомышиными антителами области контроля и внутреннего стандарта, что проявляется в образовании двух цветных полосок. Эти полоски служат знаком правильного проведения теста. 
       Если исследуемая проба содержит ПСА, то маркированный ПСА-анти-ПСА-антительный комплекс связывает фиксированное моноклональное мышиное анти-ПСА-антитело в области результата, которое, в свою очередь, распознаёт другой эпитоп ПСА. В результате образуется ещё одна цветная полоска, так что при положительном результате теста всего образуются  три  цветные  полоски.  Цветовая  интенсивность  средней линии  (внутреннего  стандарта)  соответствует  концентрации  ПСА  4 нг/мл и может быть использована для оценки концентрации нанесённой пробы [8].

Взятие и подготовка пробы

Слишком высокая концентрация ПСА приводит к т.н. «эффекту высокой  дозы» и, следовательно, к ложно-положительным  результатам теста. Диапазон измерения  данного теста лежит в пределах 2 ng/ml и 100 µg/ml ПСА. Часто наблюдается положительный результат даже при низком содержании ПСА (≈0.5 ng/ml). Для приготовления пробы:

• Развести семенную жидкость как минимум до 1:500. Разведение рекомендуется  провести в буферной жидкости 1 M TRIS с pH=8.2.

• Для экстракции ПСА из плохо растворимых материалов, содержащих пятна семенной жидкости, поместить материал в буферную жидкость и экстрагировать при 4°C в течении двух часов. При необходимости развести. После трёхминутного центрифугирования использовать всплывшую часть в качестве пробы. Согласно наблюдениям, частицы материала не препятствуют подготовке пробы.

Начало проведения теста

• Установите температуру  пробы и кассеты на уровне комнатной (18-30 °C)

• Откройте упаковку. Возьмите кассету и пипетку. В случае необходимости пометьте кассету для последующей идентификации.

• С помощью пипетки  добавьте 5 капель пробного материала (ок. 200 µl) в округлое углубление. С  этого момента начните отсчёт времени.

• После 10 минут ожидания уже можно определить результат. К этому моменту пробная жидкость должна полностью впитаться.

Результаты теста

В случае отрицательного результата происходит образование  двух красноватых полос. В случае положительного результата происходит образование трёх красноватых полос. Полоса результата (Т): видна при положительном результате,  показывает концентрацию ПСА. Полоса внутреннего стандарта: цветовая интенсивность соответствует концентрации ПСА в размере ≈ 4 ng/ml. Полоса контроля (С): проверка правильного проведения теста [9].

 

 

 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы:

 

1. Бабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с.
2. Демяшктн Г.А., Амиров Н.Ш. Паракринные механизмы регуляции функций семенника (иммуноцитохимический аспект)// Фундаментальные исследования. – 2009. - №2 – С. 88-90
3. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А., Крячок И.А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. Киев: Морион, 2003. – 156 с.
4. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14.
5. Толкунова Е.Н. Е-кадхерин как новый поверхностный маркер сперматогониальных стволовых клеток// Цитология. – 2009. – Т.51 - №3 – С. 212-218
6. Хлебникова А. Н., Селезнева Е. В., Бобров М. А. Экспрессия маркера пролиферации Ki 67 и структурного протеина клеточной адгезии E-кадхерина при актиническом кератозе// Материалы 4 Научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения», Санкт-Петербург. - 2010. –С. 154-155.
7. http://www.microtesty.ru/node/157
8. http://www.krimtex.ru/produkciya/node-ekspress-test-dlya-obnaruzheniya-sledov-spermy-cheloveka-seratec-psa-semiquant
9. http://www.seratec.com/docs/user_instructions/psm400f_ru.pdf