Иммуноцитохимическая диагностика мужских половых клеток

Федеральное государственное  бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования  «Челябинский государственный университет»

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПРОТОКОЛ №1

 

Раздел: «Иммуноморфология»

Куратор: Брюхин Геннадий Васильевич

Тема: «Иммуноцитохимическая диагностика мужских половых клеток»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

               Выполнила: Куставинова Е.В., гр. ББ-501/2

                                     Проверил: Брюхин Г.В., профессор, д.м.н., зав.кафедрой

 

 

 

 

 

 

 

Челябинск, 2013

Иммуноцитохимия – метод выявления точной локализации клеточного компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток.

 

Принцип реакции:

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к  формированию комплекса «антиген-антитело».

Антигены – чужеродные вещества сложной органической природы, способные при попадании в организм вызывать иммунные реакции.

Различают полные и неполные антигены. Полные антигены – это белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, синтетические  высокополимерные соединения, вирусы, паразиты, бактерии. Неполные антигены, или гаптены, – низкомолекулярные соединения, которые сами по себе не могут вызывать иммунного ответа, однако, соединяясь с клетками и тканями организма, в комплексе становятся полными антигенами, способными вызывать иммунный ответ.

Антитела – вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатывались.

Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов – близкие  по химическому строению и свойствам  глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, способствуют образованию антител. У человека и высших позвоночных известно 5 классов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Молекулы иммуноглобулинов (Ig) построены из легких и тяжелых полипептидных цепей, расположенных симметрично (L- и H-цепи). Легкие и тяжелые цепи состоят из двух областей – вариабельной и постоянной. Вариабельные участки принимают участие в контакте с антигеном, это определяет специфичность антител. Антитела чувствительны к протеолитическим ферментам и распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагменты сохраняют свою способность связываться с антигеном. Fc-фрагмент не способен связываться с антигеном, он определяет специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента; именно к этой части антитела можно присоединить различные вещества; в частности для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту присоединяют биотин, флуорохромы или ферменты.

Структурное разнообразие антител  определяется последовательностью  аминокислот в вариабельных областях тяжелых и легких цепей. Постоянные области иммуноглобулинов кодируются одним геном для каждого класса антител. И антитела, и антигены могут быть поливалентными (т.е. иметь множество участков связывания) в результате повторения эпитопов и в результате наличия многих эпитопов, с которыми будут связываться разные антитела.

Получение антител:

Антитела, которые используются в иммунологических методиках, получают путем повторной иммунизации  различных животных (чаще мышей, кроликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных протеинов.

Поскольку большие молекулы могут иметь несколько эпитопов, они стимулируют множество линий  В-клеток, которые синтезируют несколько видов антител к разным эпитопам одного и того же антигена. Получаемые антитела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным эпитопам антигена.

Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточного клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммунологически идентичными и реагируют с одним эпитопом антигена, к которому они были получены. Получение моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка В-лимфоцитов селезенки к слиянию; слияние с клетками миеломы; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител [1].

 

Методика проведения иммуногистохимической  реакции:

 

Фиксация:

  Фиксация необходима для предотвращения аутолиза антигенов; при этом блокируются лизосомные ферменты и предотвращается рост бактерий, которые вызывают разрушение клеточной структуры.

Выявляемый антиген  должен быть нерастворимым в жидкостях  за счет процесса фиксации его к тканевым компонентам. Идеальный фиксатор должен сохранять морфологию исследуемого материала, закреплять исследуемый антиген в месте его распределения и не нарушать его антигенные свойства.

 

Приготовление срезов тканей:

Иммуногистохимия  на криостатных срезах. Криостатные срезы подходят для выявления большинства антигенов. Срезы толщиной 5 мкм помещают на покрытые поли-L-лизином стекла и высушивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Срезы фиксируют, погружая в холодный ацетон -20 °С, либо другой фиксатор (этиловый спирт, формалин и т.п.) на 2 мин. Стекла высушивают на воздухе и проводят регидратацию в 1% неиммунной бычьей сыворотке в солевом фосфатном буфере (PBS), затем осуществляют иммуногистохимическую реакцию.

Иммуногистохимия  на парафиновых срезах. Современные методы демаскирования клеточных антигенов позволяют проводить ИГХ реакции на парафиновых срезах. При этом в качестве фиксатора может быть использован 10% раствор забуференного формальдегида.

Перед проведением ИГХ  реакции на парафиновых срезах необходимо осуществить их регидратацию. Срезы  толщиной 4-5 мкм режутся на покрытые поли-L-лизином стекла, затем высушиваются при 37°С в течение ночи и 1 час при 60 °С.

 

Демаскирование  антигенов:

После фиксации в формалине  и заливки в парафин тканевые антигены необходимо демаскировать. Эта  процедура направлена на восстановление оригинальной структуры белка. Методы демаскирования антигенов, такие как  обработка протеолитическими ферментами или нагревание в микроволновой печи после формалиновой фиксации и заключения в парафин способствуют обнаружению не выявляемых ранее антигенов.

Демаскирование клеточных  антигенов ферментами (трипсин, протеиназа К, проназа) применяется, как правило, для цитокератинов и некоторых других клеточных антигенов. Другой способ «освобождения» антигенов осуществляется путем нагревания, при этом отмечается усиление иммуногистохимической реакции на срезах, фиксированных в формалине. Для нагревания можно использовать как водяную баню, так и микроволновую печь. Как правило, нагревание срезов проводят в 10 мМ цитратном буфере при рН 6,0.

 

Протокол обработки  срезов ферментами:

• Поместить срезы в дистиллированную воду.
• Приготовить 0,1% раствор трипсина или протеиназы К в PBS (рН 7,6).
• Инкубировать при 37 °С от 15 до 60 мин.
• Остановить действие фермента ополаскиванием в холодной воде.
• Перенести в PBS.

 

Протокол обработки  срезов в микроволновой печи:

• Поместить срезы в пластиковый контейнер с 10 мМ цитратным буфером (pH 6,0).
• Нагревать срезы при мощности 700 Вт 7 мин.
• Долить испарившуюся жидкость и нагревать срезы при мощности 350 Вт 20 мин
• Остудить срезы вне печи в течение 15 мин.
• Перенести срезы в PBS.

 

 

Блокировка  эндогенной активности ферментов

Эндогенная активность пероксидазы. Пероксидазная активность встречается во многих клетках организма: эритроцитах (гемоглобин), миоцитах (миоглобин), макрофагах и нейтрофилах (цитохромы), гепатоцитах и эпителии почек (каталаза). Для нейтрализации эндогенной пероксидазной активности на срезы на 10 мин наносят 1-3% раствор перекиси водорода.

Эндогенная  активность щелочной фосфатазы. Блокирование щелочной фосфатазы осуществляют 5 мМ раствором левамизоля.

Биотин. Витамин Н – биотин – присутствует в печени, почках и др. органах. При использовании по время ИГХ реакции пероксидазно-авидинового комплекса для визуализации меченых биотином вторичных антител, возможно его неспецифическое связывание с клеточными компонентами, содержащими эндогенный биотин. Для предотвращения подобной неспецифической реакции перед осуществлением блокирования эндогенной пероксидазы проводят инкубацию срезов в 0,1% р-ре авидина, а затем в 0,01% растворе биотина в Трис-буфере (ТБС). Второй способ избежать неспецифической реакции с биотином – это использование современных безбиотиновых систем визуализации антигенов.

 

Методы окраски

Существует множество  различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена.

 

Прямой метод.  Меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом) первичные антитела наносили непосредственно на срезы. После инкубации несвязанные антитела смывали фосфатным буфером и с помощью ультрафиолетового света выявляли места локализации антигенов по зеленоватой флюоресценции.

Непрямой метод.  Этот метод более чувствителен, чем прямой. Первичные немеченые антитела наносят на срезы, а их избыток смывается буфером. Затем наносятся вторичные конъюгированные с ФИТЦ антитела, принадлежащие другому виду животных, полученные к гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови животных, использовавшихся в качестве первичных антител. В этом случае первичные антитела, связавшиеся с антигенами исследуемой ткани являются антигенами для меченых вторичных антител, которые также распределяются в месте локализации тканевых антигенов. Другим преимуществом непрямого метода является возможность применения одних и тех же меченых вторичных антител, при использовании первичных антител от одного и того же вида животных. Маркеры для этого метода могут быть флуоресцентными (флуоресцин, родамин), ферментными (пероксидаза хрена), а также коллоидное золото.

Не конъюгированный  антигенно-ферментный метод. Название связано с тем, что как первичные, так и вторичные антитела не конъюгируются с маркерами. В свою очередь, вторичные антитела используются как мостик между первичными антителами и конечными, которые также не конъюгируются, а получаются путем иммунизации животных того же вида, что и первичные антитела к пероксидазе хрена. За последним слоем антител наносится пероксидаза хрена, которая присоединяется путем реакции антиген-антитело и затем проявляется гистохимически.

Одиночный мост. Первым слоем может быть кроличья сыворотка, полученная против первичного антигена, второй слой – неконъюгированная сыворотка козы против кроличьих гаммаглобулинов и третий слой – кроличья сыворотка, полученная против пероксидазы хрена, которая затем проявляется гистохимическим методом, таким как диаминобензидин и перекись водорода по R.C. Graham и M.J. Karnovsky (1966).

Двойной мост. Он включает повторение второго слоя, сыворотки козы против кроличьих иммуноглобулинов после кроличьей антипероксидазной сыворотки и затем повторение кроличьей антипероксидазной сыворотки перед нанесением пероксидазы и её визуализацией, таким образом достигается увеличение числа мест, связывающих пероксидазу.

Пероксидазно-антипероксидазный  метод.Модификация Штейнбергом мостовой методики заключалась в проведении реакции антипероксидазных антител с пероксидазой перед нанесением их на ткани. Эта реакция приводила к образованию стабильного комплекса трех молекул пероксидазы хрена с двумя молекулами антител. Этот комплекс отделялся от непрореагировавших антител и пероксидазы перед использованием. Он реагирует как антиген третьего слоя. Первый слой составляют кроличьи антитела, реагирующие с тканевыми антигенами, второй слой образует неконъюгированная вторичная сыворотка козы против кроличьих антител в избытке, таким образом одно из парных соединительных мест антител (Fab-часть) является свободной для реагирования с третьим слоем кроличьего ПАП комплекса. Таким образом, обеспечивается высокое соотношение между количеством пероксидазного маркера и первичным антигеном. Кроличьи ПАП молекулы реагируют только с антикроличьими иммуноглобулинами козы второго слоя, и это обеспечивает отсутствие неспецифического связывания с тканью.

Авидин-биотиновый метод.  Биотин (витамин Н) в большом количестве содержится в белках птичьих яиц, где он связан с большим гликопротеидом – авидином. Авидин имеет высокую аффинность к биотину, одна его молекула может присоединить 4 молекулы биотина. Биотин может связываться с Fc-иммуноглобулинами, каждая молекула биотина имеет одно место связывания, но с одной молекулой иммуноглобулина могут связываться несколько молекул биотина. Как биотин, так и авидин могут быть помечены флуоресцентной меткой, ферментом, ферритином или молекулой золота. В этой методике первый слой представляют первичные кроличьи антитела; второй слой составляют биотинилированные антикроличьи иммуноглобулины козы; третий слой представлен авидин-биотиновым комплексом. Авидин реагирует с биотинилированной пероксидазой хрена в такой пропорции, при которой три связывающих места авидина взаимодействуют с биотинилированной пероксидазой, оставшееся одно место на каждой молекуле является свободным для взаимодействия с биотином второго слоя антител. Неконъюгированный авидин наносится на ткани для связывания биотина и затем добавляется в избытке неконъюгированный биотин для предупреждения любого связывания авидин-биотинового комплекса.

 

Протокол иммуногистохимической  реакции, предлагаемый компанией Dako.