Хроматографические методы, используемые в фармацевтическом анализе

Возможны ионообменный, ион-парный и обращенно-фазовый вариант лигандообменной хроматографии. Один из них предусматривает ковалентное связывание оптически активного агента, чаще всего аминокислоты, с матрицей сорбента. В хроматографическую систему подают подвижную фазу, содержащую ионы металла-комплексообразователя. Эти ионы связываются с оптически активным сорбентом. Модифицированный таким образом сорбент может образовывать диастереомерные хелатные комплексы. Например, если к сорбенту привита L-аминокислота, он может с рацемическим сорбатом образовывать L,L- и L,D-комплексы. Устойчивость этих комплексов различна, в результате этого параметры удерживания энантиомеров не одинаковы. В другом варианте лигандообменной хроматографии неполярный сорбент динамически модифицируется гидрофобным производным оптически активной аминокислоты, затем на нем фиксируется ион металла-комплексообразователя и при хроматографировании энантиомеров реализуется лигандообменный процесс. В третьем варианте используется стандартный обращенно-фазовый сорбент, модифицируется подвижная фаза. В этом случае диастереомерные комплексы образуются в элюенте, а сорбент энантиоселективными свойствами не обладает. Разделение достигается только за счет разной сорбируемости комплексов на гидрофобной поверхности неспецифической неподвижной фазы.

Сорбенты, используемые для удерживания катионов в лиган-дообменной хроматографии могут быть органическими, неорганическими или представлять собой комбинацию органических и неорганических структур, например, силикагели с привитыми функциональными группами. Наиболее распространенный органический катионообменник - сульфированный полистирол, сшитый дивинилбензолом. Степень сшивки 6-8%. Двухзарядные ионы, используемые в лигандообменной хроматографии вызывают электростатическое притяжение полимерных цепей, уменьшают набухаемость частиц, делая их более жесткими и устойчивыми к высокому давлению.

В качестве ПФ используют водные растворы аммиака в смеси с ацетонитрилом. Оптимальное соотношение воды и ацетонитрила находится в области эквиобъемных составов (примерно 1:1), концентрация аммиака 0.15-0.2 М. В ПФ могут добавлять соли соответствующего металла-комплексообразователя. Следует помнить, что силикагель растворяется в щелочных растворах, добавка органического растворителя уменьшает растворимость сорбента. Вместо аммиака в ряде случаев использовали пиридин. При разделении аминокислот на сульфированной полистирольной смоле, заряженной ионами цинка, в качестве подвижной фазы использовали буферные растворы ацетата натрия (рН=4.1), содержащие 3.5·10-5 М цинка.

Бумажная хроматография

Бумажная хроматография — метод анализа состава исследуемого образца. Был открыт в 1944 году Констоном, Гордоном, Мартином и Сингом, которые использовали его для анализа смесей аминокислот. Мартин и Синг впоследствии были удостоены Нобелевской премии за открытие распределительной хроматографии. В последующие 10 лет этот метод получил огромное распространение, но с 1952 года бумажную хроматографию начал вытеснять новый метод тонкослойной хроматографии (являющийся по сути обобщением бумажной). Последний оказался эффективнее благодаря большей скорости эксперимента, пригодности для препаративных целей и более широким возможностям обнаружения. Поэтому сейчас бумажная хроматография уже практически не применяются, а методы её давно не совершенствуются.

• Классификация

Бумажной хроматографию, как и хроматографию вообще, можно разделить на распределительную, адсорбционную и ионообменную, а также на препаративную ианалитическую. В распределительной бумажной хроматографии можно выделить нормальную и обращённо-фазную хроматографию. В последнем случае (в отличие от нормального подхода) неподвижная фаза более липофильна, чем подвижная. Этот метод применяется для разделения липофильных веществ.

• Носитель

При распределительной БХ носителем неподвижной фазы является целлюлоза в виде листов бумаги, которая даже в высушенном виде содержит значительное количество связанной воды. Распределение происходит между связанной водой и растворителем, хотя присутствуют и адсорбционные эффекты. Для БХ применяется качественная бумага, которая может быть модифицирована в соответствии с поставленными задачами. Также используется бумага из стекловолокна, которая устойчива ккоррозионно-активным реагентам и обладает низкой адсорбционной способностью.

Один из наиболее ранних способов модифицирования хроматографической бумаги — ацетилирование. Бумага, полученная таким образом, используется для обращённо-фазной хроматографии. Позднее было обнаружено, что эта бумага пригодна и для разделения рецемических смесей, так как ацетилцеллюлоза сама является хиральным веществом и потому энантиомеры перемещаются по ней с различной скоростью. Как носители неподвижной липофильной фазы применяются также силиконы.

• Методика

В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают. Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных сил растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца. До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат. Затем образовавшиеся пятна, которые могут быть как видимые, так и невидимые, обнаруживают и отмечают.

Отношение расстояния, пройденного пятном, к расстоянию, пройденному растворителем стандартно обозначается Rf. Эта величина зависит от вещества, бумаги и природы растворителя. Бумажные хроматограммы могут проявляться в восходящем, нисходящем и горизонтальном токе растворителя, что слабо отражается на их качестве. Поэтому выбор определяется другими факторами: по сравнению с восходящей хроматографией нисходящая имеет определённые преимущества. А именно, она требует меньше времени и не ограничена по длине пробега. С другой стороны, для нисходящей БХ играет важную роль тщательность подготовки камеры, так как загрязнение или плохой контакт бумаги в месте соприкосновения со стенкой лодочки может приводить к неоднородному току и, как следствие, образованию полос.

Буш и Кроушоу предложили методику скоростной БХ. Эта методика предусматривает применение более узких камер, горизонтальное хроматографирование, насыщение атмосферы камеры парами растворяющей системы, а главное — предварительную пропитку бумаги водной неподвижной фазой. Нередко весьма эффективна оказывается т. н. двумерная БХ, которая заключается в том, что после проведения хроматографии в одном направлении бумагу высушивают и повторно хроматографируют с другим растворителем под прямым углом к первоначальному направлению. При этом часто происходит разделение веществ, которые не разделяются в первом растворителе.

• Обнаружение

Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различныереагенты, или же по радиоактивности. Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем.

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) — разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

• Принцип

В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определенного диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объем). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируется вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

• Сорбенты

Гель — гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор стационарной или твердой фазы, называемой гелевой матрицей.

• Низкого давления

• агароза,
• декстран,
• полиакриламид,
• сефадекс,
• сефакрил,
• сефароза,
• супердекс.

• Высокого давления

• полиметакрилат,
• полистирол,
• силикагель

Методом афинной хроматографии разделяют полипептиды, белки и другие макромолекулы биологически активных веществ. Разделение происходит за счет различия в их биоспецифическом взаимодействии с комплементарными сорбционными центрами неподвижной фазы. По сути, это вариант лигандообменной хроматографии, дополняющийэксклюзионную и ионообменную хроматографию, применение которого необходимо, если важно сохранить активность, повысить выход и степень очистки препаративно выделяемого компонента.

Схематично механизм разделения в афинной хроматографии представлен на рисунке.

Механизм разделения веществ в афинной хроматографии: а) иммобилизация лиганда на матрице; b) нековалентное связывание целевого вещества и удаление сопутствующих примесей; с) десорбция целевого компонента.

 Лиганд L фиксируется на матрице, целевой компонент разделяемой  смеси S связывается лигандом и  извлекается из раствора, в последующей  стадии элюирования комплекс  разрушается и сорбат вновь  переходит в раствор. Взаимодействие вещества и лиганда должно быть обратимым. Лиганд при помощи реакционно-способных групп осуществляет связь с матрицей, сохраняя при этом биоспецифическую активность. Активные центры многих биологически активных веществ часто локализованы в середине глобулы и недоступны для небольших структур лигандов, непосредственно связанных с матрицей. Поэтому между матрицей и лигандом часто встраивают дополнительный блок - спейсер.

Для афинной хроматографии выпускают материалы с различными реакционно-способными группами. В качестве матрицы служат разнообразные гели на основе агарозы или полиакриламида. Тип геля выбирают по виду функциональных групп лиганда. Известны матрицы, на которых лиганды могут быть иммобилизированы только с помощью конденсирующих агентов. Например, в качестве конденсирующих агентов применяют водорастворимые производные карбодиимида (N-этил-N'-(3”-диметиламинопропил)-карбодиимидгидрохлорид и др.).

Лигандообменную хроматографию белков называют также металло-хелат-афинной хроматографией.

Матрица сорбента должна быть доступной для макромолекул белка, чтобы обеспечить возможность образования разнолигандных сорбционных комплексов. Этому условию удовлетворяют гели с высокой набухаемостью (сефадекс 6В, СМ-сефадекс С-50, трисакрил GF 2000 и другие так называемые аффи-гели) и слабосшитые ионообменники. В качестве подвижной фазы используют буферы в интервале значений рН от 6 (ацетатный буфер) до 8 (фосфатный буфер). Можно создать такие условия (значения рН и концентрация солей) при которых взаимодействие целевого сорбата с лигандом будет наиболее сильным. Десорбцию и элюирование связанного белка осуществляют тремя способами. Так, при понижении рН подвижной фазы происходит протонирование донорных групп белка и диссоциация его сорбционного комплекса.

Следует помнить, что иминодиацетатные группы неподвижной фазы также способны протонироваться и терять связанный с ними ион металла, в связи с этим рН меньше 5 нежелательны. Молекулы белка можно вытеснить из сорбента лигандным обменом, используя имидазол. Последний образует более устойчивый комплекс. Наконец, сорбционные комплексы можно разрушить при низких рН средним по силе хелатообразующим агентом (гистидином) или сильным хелатирующим агентом (этилендиаминтетрауксусной кислотой), что приводит к освобождению белка и десорбции металла. Этот способ эффективен для выделения ферментов, принадлежащих к классу металлопротеинов. Молекулы белка, не имеющие на своей поверхности остатков гистидина или триптофана не удерживаются гелем IDA-Cu2+, а присутствие хотя бы одного остатка гистидина в молекуле белка достаточно для его удерживания гелем IDA-Cu2+ при нейтральном значении рН. Для удерживания белков, содержащих триптофан, требуется несколько остатков этой аминокислоты в молекуле белка. Если сорбат слишком прочно связан с лигандом, в состав буфера вводят анионы ClO4-, CF3COO-, SCN-, CCl3OO-, разрушающие водородные связи.