Хроматографические методы, используемые в фармацевтическом анализе

а) свободная ОН-группа 
б) связанная ОН-группа 
в) геминальная ОН-группа 
г) реакционноспособная ОН-группа.

ЖАХ основана на конкурентном взаимодействии полярных групп вещества и молекул растворителя с активными центрами адсорбента на его внутренней поверхности. Поверхность силикагеля, находящегося в равновесии с подвижной фазой всегда покрыта более или менее прочно связанным адсорбционным слоем. Если подвижная фаза содержит два или более компонентов, то состав адсорбционного слоя отличается от состава в объеме подвижной фазы. Адсорбция молекулы сорбата может происходить с вытеснением одной или нескольких молекул адсорбированного слоя или без него. Процессы взаимодействия молекул сорбата с адсорбционными слоями и поверхностью твердого адсорбента весьма сложны, главную роль в них играют ион-дипольные и диполь-дипольные взаимодействия. Селективность разделения в ЖАХ определяется не только межмолекулярным взаимодействием молекул данного сорбата, но и межмолекулярными взаимодействиями молекул ПФ как с адсорбентом, так и с молекулами сорбата, находящимися как на поверхности адсорбента, так и в адсорбционном слое и в объеме элюента.

В целом наблюдаются следующие закономерности. 
Удерживание возрастает: 
а) с увеличением полярности сорбата; 
б) с уменьшением числа атомов углерода в его молекуле; 
в) по мере уплощения молекулы и при увеличении числа π-электронов (для полиядерных соединений). 
Удерживание уменьшается: 
а) с увеличением степени экранирования полярных групп сорбата орто-заместителями; 
б) при увеличении полярности подвижной фазы; 
в) по мере дегидроксилирования поверхности адсорбента.

Полярность сорбата определяется числом и характером полярных функциональных групп. Ниже приведены ряды функциональных групп органических веществ, расположенных в порядке возрастания адсорбируемости на силикагеле:

-СН2- < -СН3 < -СН=СН- < -S-R < -O-R < NO2 < -NH-(карбазол) < -C(0)OR < -С(0)Н < -C(0)R < -ОН < -NH2 < -С(0)ОН

F- < Сl- < Br- < I- < -OR < -NR2 < -N02 < -C(0)OR < -C(0)R <-C(0)H < -NH2 < -NH-C(0)R < -OH < -C(0)OH < -SO3H

Уже некоторые несоответствия в двух приведенных выше эмпирических рядах показывают, что они носят приблизительный характер, поскольку существуют различия между алифатическими и ароматическими соединениями, имеет место влияние дипольного момента и поляризуемости молекулы, стерический факторы, кислотность адсорбента, полярность и селективность подвижной фазы.

ЖАХ на силикагеле обеспечивает наибольшую селективность при разделении соединений, имеющих различные функциональные группы и различное число таких групп. В тоже время разделение веществ гомологов и вообще веществ по молекулярной массе в силу специфического механизма удерживания в этом варианте хроматографии не эффективно. Разделение членов гомологического ряда достигается только для первых членов и быстро падает с ростом числа метиленовых групп. Ограничением метода является растворимость сорбатов, они должны удовлетворительно растворяться в органических растворителях. Хроматографическая система в ЖАХ очень чувствительна к влаге, медленно стабилизируется, поэтому градиентная хроматография на силикагеле имеет плохую воспроизводимость параметров удерживания и не целесообразна для рутинных анализов.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография – способ анализа (реже препаративного разделения) смесей жидких или твердых веществ, основанный на различном сродстве разделяемых веществ к неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент) фазам. Как правило, чем лучше вещество сорбируется неподвижной фазой - тем медленнее вещество двигается по пластине. Тонкослойная хроматография чрезвычайно чувствительный метод, позволяет обнаруживать до ~0.5 масс.-% примесей.

• Область применения

1. Анализ смесей жидких или твердых веществ, различающихся по Rf.
2. Анализ реакционных смесей, мониторинг протекания химических реакций.
3. Мониторинг проведения колоночной хроматографии и контроль чистоты отбираемых фракций.
4. Определение чистоты конечного продукта.

• Оборудование

Типичный прибор для проведения ТСХ анализа приведен на рисунке:

1. Капилляр. Представляет собой стеклянную трубку с внутренним диаметром 0.3-1.0 мм, вытянутую в пламени Важно! Оба конца капилляра должны быть открыты). Края капилляра должны быть ровными, чтобы не царапать слой сорбента и при легком прикосновении переносить раствор вещества на пластину. Важно! Чем уже капилляр, тем легче получить небольшое пятно вещества на пластине. В качестве капилляра также удобно использовать насадки для пипетмана (см. фото выше).

2. Ёмкость для ТСХ. Химический стакан с плоским дном, на дно которого наливается элюент слоем 4-6 мм. Для воспроизводимых результатов дно и стенки емкости выкладываются фильтровальной бумагой, которая пропитывается элюентом. Емкость закрывается крышкой (или чашкой Петри, часовым стеклом) для избежания испарения элюента.

3. Элюент.

Требования к элюенту

1. Выделяемые вещества не должны взаимодействовать с элюентом или разрушаться в его присутствии. Пример: гидролиз эпоксидов или ацеталей водой на силикагеле.
2. Элюент может быть или индивидуальным растворителем или смесью нескольких растворителей. Растворители должны легко удаляться после проведения анализа (поэтому диметилсульфоксид (ДМСО) или диметилформамид (ДМФА) не подходят из-за высокой температуры кипения).
3. Элюент подбирают таким образом, чтобы пятно целевого вещества выходило с Rf не более 0.5-0.6 после одного прогона хроматограммы и было хорошо дифференцировано от примесей (~0.1 Rf). Если на старте остались еще вещества (Rf = 0, "сидят на старте"), следует сменить элюент и проанализировать состав этой смеси. Иногда целевое вещество может "сидеть на старте".
4. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту.  
   Пример: Rf = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.  
   Пример: Rf = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой. 
• Количество элюента. Элюент наливается в емкость до образования слоя 4-6 мм. Важно!Пластину погружают в элюент так, чтобы пятна веществ не соприкасались непосредственно с элюентом, иначе произойдет вымывание веществ в элюирующую смесь.
2. Сорбент. Выбирается исходя из свойств разделяемой смеси.
• Требования к сорбенту.
1. Разделяемые вещества не должны разрушаться в присутствии сорбента.Пример: разделение и очистка ацеталей на силикагеле (у него кислая реакция) практически невозможна из-за их разрушения. В то время как на нейтральном Al2O3 их удается эффективно разделить. 
2. Если под действием растворителей различной полярности (полярных (метанол, возможно с добавлением уксусной кислоты или триэтиламина) и неполярных (гексан, пентан)) вещество не сдвигается со старта или двигается с фронтом, следует перейти к другому сорбенту (от полярного сорбента к неполярному и наоборот).  
   Пример 1: Rf = 0, так ведут себя высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на силикагеле; или неполярные вещества на сорбентах с обращенной фазой.  
   Пример 2: Rf = 1, так ведут себя неполярные вещества на силикагеле; или высоко полярные вещества (ионные жидкости, амины) на сорбентах с обращенной фазой.
3. Пластина.
• Ширина пластины определяется: по 5 мм от краев пластины, и 4-6 мм расстояние между пятнами. Длина пластины: от 5 см (для хорошо разделяющихся веществ) до 10 см или более (для сложных смесей).
• Линия "старта" проводится карандашом на расстоянии 5-7 мм от нижнего края пластины, с этого же края отрезаются уголки (~2 мм) для того, чтобы фронт элюента шел по пластине ровным слоем.
• Вещество наносится на пластину в виде раствора с достаточно небольшой концентрацией (иначе возможна "перегрузка пластины", т.е. вещества будут выходить длинной растянутой линией, не разделяясь) при помощи капилляра. Диаметр пятен 3-5 мм. При мелких пятнах <2 мм вещество на пластине сильно концентрировано, в результате - плохое разделение. При больших пятная >6 мм - вещество сильно размывается при элюировании затрудняя дифференциацию пятен.
• При анализе фракций колоночной хроматографии. Пятна нумеруют. Если все фракции не помещаются на одну пластину, то последняя фракция с предыдущей пластины также наносится на текущую пластину - для сравнения.  
  Пример: на 1 пластине наносят фракции с 1 по 10, на второй с 10 по 19, на третьей с 19 по 28 и т.д.
• Линия "финиша" проводится карандашом после окончания элюирования на расстоянии 3-5 мм от верхнего края пластины. Важно! Для воспроизводимых результатов фронт элюента не должен достигать края пластины.
4. Обнаружение пятен. 
   Большинство органических соединений не окрашены, т.о. не удается визуально определить положение пятен на пластине. Поэтому, после проведения ТСХ анализа требуется проявить пятна в ультрафиолетовом свете (УФ), йоде (I2) или под действием специальных реагентов. 

Жидкостно-жидкостная хроматография

Жидкостно-жидкостная хроматография ( ЖЖХ), представляющая собой разновидность распределительной хроматографии или растворной хроматографии. Образец распределяется между подвижной жидкостью, обычно водой, и неподвижной жидкостью, обычно органическим растворителем. Подвижная жидкость не должна растворять неподвижную жидкость. 

Жидкостно-жидкостная хроматография по сути близка к газожидкостной хроматографии. 

Жидкостно-жидкостная хроматография ( ЖЖХ), представляющая собой разновидность распределительной хроматографии или растворной хроматографии. Образец распределяется между подвижной жидкостью, обычно водой, и неподвижной жидкостью, обычно органическим растворителем. Подвижная жидкость не должна растворять неподвижную жидкость. 

Распределительная жидкостно-жидкостная хроматография может осуществляться в трех вариантах: колоночном, на бумаге и в тонком слое. 

В жидкостно-жидкостной хроматографии и подвижной и неподвижной фазами являются жидкости. 

В жидкостно-жидкостной хроматографии и подвижной, и неподвижной фазами служат жидкости. 

Разделение смеси веществ в жидкостно-жидкостной хроматографии основываются на различии коэффициентов распределения вещества между несмешивающимися растворителями. 

В зависимости от агрегатного состояния подвижной и неподвижной фаз различают газо-адсорбционную, газо-жидкостную, жидкост-но-адсорбцнонную и жидкостно-жидкостную хроматографию. В газоадсорбционной хроматографии подвижной фазой служит газ, называемый газом-носителем, а неподвижной фазой - твердый адсорбент. В качестве адсорбента в газовой хроматографии используют активированные угли, силикагели, окись алюминия и другие пористые вещества с сильно развитой поверхностью. 

В зависимости от агрегатного состояния подвижной и неподвижной фаз различают газоадсорбционную, жидкостно-адсорбционную, газожидкостную и жидкостно-жидкостную хроматографию. В газоадсорбционной хроматографии подвижной фазой служит газ, называемый газом-носителем а неподвижной фазой - твердый адсорбент. 

Тай и Белл  обнаружили, что пирен и флуорантен легко отделяются с помощью жидкостно-жидкостной хроматографии в виде комплексов с сыж-тринитробензолом, которые образуются на носителе Columnpax ( фирма Fisher, Sci. Буу-Хой и Джекинон использовали сродство ангидридов и имидов тетрагалогенфталевых кислот к ароматическим и гетероциклическим полициклическим соединениям для проведения колоночной хроматографии на этих ангидридах и имидах. 

С реализацией высоких и сверхвысоких давлений начинает проявляться целый ряд новых эффектов, присущих только данной области сверхвысоких давлений, когда плотность газообразного элюента приближается к плотности жидкости и растворяющая способность жидкостноподобных газов, используемых в качестве подвижной фазы, становится сравнимой с растворяющей способностью обычных растворителей, применяемых в качестве элюентов в жидкостно-жидкостной хроматографии. 

Поиск несмешивающихся фаз, обеспечивающих разделение, обычно производится эмпирически на основе экспериментальных данных. Широкое применение в жидкостно-жидкостной хроматографии получили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихся растворителей и третьего, растворимого в обеих фазах. Такие системы позволяют получать набор несмешивающихся фаз различной селективности. В качестве примера можно привести систему из несмешивающихся между собой гептана и воды, в которую введен этанол, растворяющийся в обоих растворителях. 

В жидкостной хроматографии в качестве подвижной фазы используют жидкость. Так же как и в газовой хроматографии, в зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы могут быть варианты жидкостно-адсорбционной и жидкостно-жидкостной хроматографии.

Газовая хроматография

Газовая хроматография — один из многих видов хроматографии. Описанная впервые в 1952 г. она стала популярной благодаря:

• быстроте и легкости, с которой могут быть проанализированы сложные смеси;

• очень малой требуемой пробы для анализа;

• гибкости и надежности используемого оборудования.

Фазовые системы

Этот термин в газовой хроматографии обозначает комбинацию используемых подвижной и неподвижной фаз.

Неподвижная фаза состоит из твердых частиц, предпочтительно с узким интервалом по размерам. Их средний размер обычно 0,1-0,3 мм, хотя в некоторых случаях для достижения очень высокой эффективности газохроматогра-фических колонок используются частицы меньшего размера. С точки зрения химического состава и свойств используемые неподвижные фазы могут быть подразделены на три группы.

1) адсорбенты, обычно с очень большой удельной поверхностью (50-1000 м2/г): силикагель, оксид алюминия, молекулярные сита, активный уголь и графитированная сажа. Газоадсорбционная хроматография — не очень распространенный метод, за исключением анализа газов или решения особых задач;

2) нейтральные, или так  называемые инертные носители, обычно получают из диатомитовых материалов, иногда из полимеров.

На них наносится жидкость с очень низким давлением пара и высокой термической стабильностью в условиях использования колонки. В настоящее время газожидкостная хроматография является самым распространенным методом.

В газовой хроматографии наиболее часто используются следующие инертные носители: карбопак (А, В, С), хромо-сорб (A, W, G, Р), молекулярные сита, графитированная сажа, цеолиты и др.

В качестве неподвижной фазы в газожидкостной хроматографии наиболее часто используются: апиезон М, карбо-вакс 20М, карбовакс 1500, дексил 300, дексил 400, дибутил-фталат, диэтилен-гликольадипат, динонилфталат, полифе-ниловый эфир, полипропиленгликоль, поливинилпирролидон, силикон GESF 96, силикон GEXE 60, силикон SE 30, фенил-силикон SE 52 и др.;

3)для проведения очень трудных  разделений успешно используются  также адсорбенты с нанесенным на них малым количеством жидкости с низким давлением пара. Этот метод обычно называется газовой хроматографией на адсорб

ционных слоях или газоадсорбционной хроматографией на модифицированных адсорбентах.

Подвижной фазой служит инертный газ (гелий, азот, аргон) или такой газ, как водород, который в условиях газовой хроматографии проявляет себя как инертный. В некоторых случаях используют водяной пар или безводный аммиак. Химический состав газа-носителя оказывает весьма незначительное влияние на удерживание веществ и на их разделение.

С другой стороны, физические свойства подвижной фазы и особенно значительная сжимаемость газов, большое значение коэффициента диффузии и большое различие между парциальными молярными объемами в подвижной и неподвижной фазах имеют существенное влияние и являются причиной значительных различий между газовой хроматографией и жидкостной.

Схематическое описание газового хроматографа

Имеется много практических реализаций принципов газовой хроматографии, однако по своим основным конструктивным особенностям вся ГХ-аппаратура очень схода. На рис. 4.5 приведено схематическое описание газового хроматографа.

Основными блоками газового хроматоргафа являются следующие: • Блок подготовки газа-носителя, который подает стационарный поток выбранного газа-носителя. В самых распространенных системах используется регулятор скорости потока. Массовая скорость потока газа-носителя через этот регулятор поддерживается постоянной. Другими словами, число молей газа, проходящего через колонку в единицу времени, является постоянным. • Система ввода проб, которая обеспечивает ввод точного количества пробы в этот поток газа точно в начало колонки. Эта проба должна испаряться за достаточно короткое время и вводиться в колонку в виде цилиндрической пробки пара, разбавленного газом-носителем. • Колонка, которая установлена в термостате с регулированием температуры. Выбираемая температура обычно заключается в диапазоне от комнатной температуры до 350°С, хотя были описаны анализы в более широком диапазоне (от -180 С до +1000°С). • Детектор, который обеспечивает сигнал, пропорциональный составу газа-носителя. Желательно, чтобы этот сигнал был нулевым, когда из колонки выходит чистый газ-носитель, и пропорциональным концентрации любого вещества, отличающегося от газа-носителя. Такой детектор называется линейным. Если коэффициент пропорциональности одинаков для всех веществ, детектор называется идеальным. На практике идеальный детектор не существует. Компоненты смеси переносятся по колонке газом-носителем. Они движутся со скоростью, которая пропорциональна линейной скорости газа-носителя, но меньше ее и зависит от силы взаимодействия каждого из этих компонентов с неподвижной фазой. Соответственно, если неподвижная фаза была выбрана правильно, каждый компонент находится в колонке или элюируется разное время и отделяется от других компонентов. Сигнал детектора позволяет проводить идентификациюкаждого компонента по времени элюирования его зоны (также называемом его временем удерживания) и его количественное определение по величине сигнала детектора (его высоте или площади). Таким образом, хроматографический процесс является последовательным процессом. Каждому вводу пробы соответствует разделение, сопровождающееся детектированием. Из данных, записываемых во время хроматографического анализа, можно отметить пять параметров для каждого пика Этими пятью основными экспериментальными данными являются: время удерживания, время задержки газа, ширина пика, высота пика, площадь пика. 1. Время удерживания tR. Это время между вводом пробы и появлением на выходе из колонки максимальной концентрации зоны соответствующего вещества. По времени удерживания проводится идентификация разделяемых веществ. 2. Время задержки газа tm. Это время удержания инертного вещества, которое не удерживается на колонке, т. е. вещества, не адсорбируемого или не растворяемого неподвижной фазой. 3. Ширина пика w. Ширина пика обычно определяется как длина сегмента нулевой линии, измеряемая между точками пересечения с нулевой линией двух касательных в точках перегиба пика. Используется также ширина пика на половине его высоты или на некоторой другой промежуточной высоте. 4. Высота пика h. Это расстояние между нулевой линией и максимумом пика. 5. Площадь пика А, которая в  настоящее время измеряется интегрированием  сигнала. По площади пиков проводится  количественный анализ. Газо-адсорбционная хроматография Газо-адсорбционная хроматография представляет собой метод анализа смесей газов и легколетучих веществ. Разделение основано на различии в адсорбции на поверхности твердого носителя (адсорбента). Адсорбция может быть обусловлена неспецифическими (ориентационными, индукционными и дисперсионными) и специфическими взаимодействиями (комплексообразованием, либо образованием водородной связи) и зависит от природы адсорбента и сорбата. В качестве адсорбентов используют пористые носители, которые обладают химической, физической и термической стабильностью; однородной поверхностью, равномерным распределением по размеру пор и известной адсорбционной активностью. Адсорбционная активность зависит от удельной поверхности (определяется геометрической структурой носителя) и удельной поверхностной энергии (определяется химической структурой поверхности). Достоинствами адсорбентов в качестве неподвижных фаз являются способность выдерживать высокие температуры, отсутствие фонового сигнала при работе с ионизационными детекторами и высокая селективность. Адсорбенты делятся на неорганические, полимерные (органические) и модифицированные. Среди неорганических адсорбентов особо важны сорбенты на основе углеродных материалов. Это неполярные сорбенты, для них особую роль в процессе разделения играют геометрические параметры поверхности. Наиболее интересная особенность данных материалов – возможность разделения структурных изомеров. Широко используются полярные неорганические сорбенты на основе двуокиси кремния. Особый интерес для газо-адсорбционной хроматографии представляет использование цеолитовых молекулярных сит (M2/nO•Al2O3•xSiO2•yH2O), которые успешно позволяют разделять различные газовые смеси. Применение адсорбентов на основе Al2O3 ограничено из-за его гетерополярной поверхности, гигроскопичности и асимметрии пиков разделяемых соединений. Сорбенты используют для разделения легких углеводородов. Наиболее многообразны полимерные сорбенты на основе пористых полимеров стирола и дивинилбензола. Их удается синтезировать с заданными свойствами и очень чистой поверхностью. Это гидрофобные сорбенты, слабо удерживающие полярные молекулы, содержащие гидрокси-амино-группы. Основная область применения полимерных сорбентов – разделение полярных и реакционно-способных газов и высоко полярных органических соединений; определение воды в органических растворителях и летучих органических примесей в воде. Метод газо-адсорбционной хроматографии обычно используют для оценки содержания в атмосферном воздухе кислорода, водорода, метана, углекислого газа, окиси углерода, окислов азота, хлора, диоксида серы, сероводорода и сероуглерода. Положительным для газо-адсорбционного метода анализа является: · только в этом случае проявляется высокая разделительная способность при анализе смесей газов и паров низкокипящих веществ; · нелетучесть твердого адсорбента; · термическая стабильность адсорбента в широком интервале изменения температуры хроматографической колонки; · более высокая скорость массообмена, чем в варианте газо-жидкостной хроматографии, что приводит к быстрому разделению смесей веществ; · возможность модифицирования поверхности адсорбента; · достаточная механическая прочность адсорбентов; · доступность адсорбентов. К недостаткам метода следует отнести: · недостаточную геометрическую однородность поверхности адсорбентов; · недостаточное постоянство химического состава поверхности адсорбентов из-за наличия примесей; · повышенную адсорбционную активность адсорбентов; · повышенную каталитическую активность адсорбентов; · нелинейность изотермы адсорбции; · недостаточно широкий выбор адсорбентов. Ионообменная хроматография