Характеристика субстратов и сред, применяемых в фармацевтической биотехнологии

Кислород и вода.

Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от источника окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов .Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74—2,6 кг молекулярного кислорода. Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов. При давлении 0,1 МПа (1 кгс/см2) и температуре 30 °С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода 2-—5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5—2 мин. Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50—60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов— 10—20%.

Вода составляет 80—90 % биомассы микроорганизмов. Для  приготовления питательных сред требуется чистая бесцветная вода, без привкуса, запаха и осадка, отвечающая требованиям ГОСТа. В воде, используемой для приготовления питательных сред, должно содержаться не более 50 мл/л хлоридов и не более 60 мг/л сульфитов.

 

 

 

 

  2.3. Питательные среды и их характеристика

Для культивирования  бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований:

1. Питательность. Бактерии должны содержать все необходимые питательные вещества.

2. Изотоничность. Бактерии должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления, определенную концентрацию хлорида натрия.

3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.

4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).

6. Стерильность.

Классификация питательных сред.

1. По происхождению:

1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);

2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений.

2. По составу:

1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон;

2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточный агар, желточно-солевой агар, среда Китта—Тароцци.

3. По консистенции:

1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);

2) полужидкие (0,15—0,7 % агар-агара);

3) жидкие (не содержат агар-агара).

4. По назначению:

1) общего назначения – для культивирования большинства бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар);

2) специального назначения:

а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется (щелочной бульон, 1 %-ная пептонная вода, желточно-солевой агар, казеиново-угольный агар и др.);

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среда Эндо, Левина, Гиса, Плоскирева и др.);

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида (селенитовый бульон).

Стандартные среды для ведения  культур животных клеток.

Среды Игла MEM (minimal essential medium) и BME (basal medium, Eagle). Чаще используется МЕМ. Она содержит минеральные вещества, аминокислоты (13 незаменимых), 6 водорастворимых витаминов, холин и инозит, выполняющие роль углеводородного субстрата. МЕМ используется только с сывороткой, так как в ней отсутствуют биотин, витамин В12, ионы железа и микроэлементы. Основа - раствор Эрла.

Среда Дульбекко DME или DMEM (двойная модификация среды Игла). Используется при культивировании клеток различных типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом. Является основой для бессывороточных сред. Содержит двойную концентрацию аминокислот, глицин, серин, пируват, железо. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2.

Среда Искова IMDM -  модификация среда Дульбекко. Добавлены незаменимые аминокислоты, биотин, витамин В_12, селенит натрия. В среду введен HEPES и уменьшены концентрации NaCl и NaHCO₃. Среда бессывороточная, обычно используется для культивирования лимфоцитов и кроветворных клеток.

Среда МакКоя 5А и серия сред RPMI. Среда МакКоя 5А разработана  в 1958 году для поддержания клонального  роста клеток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем уже других первичных культур и различных клеточных линий. Обычно производится в модификации Ивката и Грейса (RPMI) и предназначена для культивирования лейкоцитов в присутствии сыворотки, часто применяется и для культивирования гибридом. Концентрация СО₂в атмосфере при культивировании 5%.

Среда 199 разработана в 1950 году для  культивирования фрагментов сердца из эмбриона цыпленка. Для среды  характерны широкий спектр питательных  веществ и невысокая их концентрация. Используется без добавок, как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой как ростовая среда для быстро размножающихся клеток. Нормальные, сохраняющие специфические функции клетки на стандартных средах не размножаются (если не трансформированы). Для оптимального роста клеток обычно добавляют 5 - 20% фетальной (эмбриональной) сыворотки.

Важным фактором роста практически для всех типов клеток является гормон инсулин. Из других гормонов наиболее часто применяются глюкокортикоиды (гидрокортизон, дексаметазон), стероиды (эстрадиол, тестостерон, прогестерон) и гормоны щитовидной железы (трииодтиронин). Гормоны стимулируют или подавляют рост в зависимости от типа клеток и их плотности. Глюкокортикоиды, например, влияют на пролиферацию клеток, изменяя их чувствительность к факторам роста.

Для переноса низкомолекулярных факторов (витаминов, аминокислот, липидов и  других) необходимы транспортные белки. В этой роли выступает альбумин. Транспорт железа обеспечивает трансферрин, а поверхность большинства культивируемых клеток содержит рецепторы для этого белка. К факторам прикрепления и распластывания клеток относятся коллаген и фибронектин, более специализированы хондронектин (адгезия хондроцитов) и ламинин (адгезия эпителиальных клеток).

В последние годы разработаны бессывороточные  среды для размножения клеток. Чаще всего эти среды узко специализированы. К базовой среде добавляется инсулин, трансферрин, гидрокортизон или его аналог дексаметазон и т.д. Бессывороточные среды имеют определенные преимущества: улучшение воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмой; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных белков на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксичности сыворотки. Культивирование клеток в присутствии сыворотки обнаруживает и ряд недостатков: для большинства тканей сыворотка не является физиологической жидкостью, с которой они контактировали в исходной ткани, поэтому, например, сыворотка вызывает рост фибробластов, но тормозит рост эпидермальных кератиноцитов; сыворотка может быть цитотоксичной, так как содержит полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток (эмбриональная сыворотка содержит относительно много такого фермента); значительная вариабельность состава сывороток разных партий; сыворотки могут содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость добавления их к культурам клеток.

Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и  образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться  на нем. В связи с этим встает вопрос о подходящем материале. В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов. Стекло лучше всего пирекс (алюмоборосиликатное стекло), так как натрийсиликатное стекло может подщелачивать среду и его необходимо кипятить в слабой кислоте перед употреблением. С каждым использованием пригодность такого стекла падает. Пластик - чаще всего используют полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и другие. Металлы - подходит как нержавеющая сталь, так и титан, так как эти вещества химически инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Этого можно достичь химической обработкой окисляющими агентами или физическими воздействиями (высоковольтным разрядом, ультрафиолетовым светом, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами). Фирмы, производящие пластиковую посуду, используют эти методы. Некоторые исследователи, несмотря на это, предпочитают даже новую посуду перед посадкой клеток обрабатывать смесью концентрированной серной кислоты и бихромата калия (хромовая смесь), после чего следует тщательная промывка. Иногда поверхность сосуда покрывают веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто для этого используют коллаген и полиаминокислоты.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                            Заключение.

Биотехнология - это производственное использование биологических агентов  или их систем для получения ценных продуктов и осуществления процессов  различного назначения. В целом, биотехнология представляет собой систему приемов, позволяющих получать промышленным способом ценные продукты за счет использования процессов жизнедеятельности живых организмов.

В фармацевтической промышленности биотехнологии  применяются для производства антибиотиков, иммунобиологических препаратов, генно-инженерных лечебно-профилактических препаратов, для производства энзимов, биологически активных веществ и других медицинских препаратов. Важным направлением биотехнологий в медицине является использование биотехнологий для реконструкции тканей и органов человека с использованием стволовых клеток.

Ежегодный прирост мирового рынка  биотехнологической продукции составляет 7-10%. Уже сегодня использование  биотехнологических разработок позволяет  решать многие проблемы диагностики и лечения особо опасных заболеваний, недостаточного или несбалансированного питания, повышения качества питьевой воды, обеззараживания опасных для человека и окружающей среды отходов.

В настоящее время биотехнология  решает проблемы не только медицины или создания пищевых продуктов путем ферментации (традиционной области ее применения); с ее помощью ведется, например, разработка полезных ископаемых, решается проблема энергоресурсов, ведется борьба с нарушениями экологического равновесия и т.д. В некоторых странах (например, Японии) биотехнология объявлена «стратегической индустрией», а в других (например, Израиле) включена в число научных направлений с указанием «национальный приоритет». В США число биотехнологических фирм за 1985 — 2005 гг. достигло полутора тысяч. В Европе их несколько сотен.

Характерен рост числа специализированных периодических изданий по биотехнологии, выпускаемых в разных странах, международных  и региональных биотехнологических конгрессов и конференций.

 

 

 

                                               ГЛОССАРИЙ

Азеотропные смеси (азеотропы) - жидкие смеси, характеризующиеся равенством составов равновесных жидкой и паровой фаз. При их перегонке образуется конденсат того же состава, что и исходный р-р; поэтому азеотропные смеси наз. также нераздельнокипящими. Наличие азеотропных смесей существенно затрудняет разделение жидких смесей и требует применения специальных методов ректификации.

 Амилазы — ферменты класса гликозил-гидролаз, катализирующие гидролиз крахмала, гликогена и других родственных полисахаридов главным образом по α-(1→4)-гликозидной связи с образованием олиго- и моносахаридов. Амилазы также называют ферментами пищеварения. 

Глюкокортикоиды - гормоны, выделяемые корой надпочечников человека и позвоночных животных. Г. относятся к стероидам, характеризуются наличием группы HO— или О = С  при 11-м и 17-м атомах углерода.

Колония – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде.

Питательная среда — вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов.

Ферменты (лат. Fermentum – брожение, бродильное начало) – это специфические белки, способные во много раз ускорять биохимические реакции, протекающие в живых организмах, не входя при этом в состав конечных продуктов реакции.

Цитотоксичность. - свойство физических воздействий или химических веществ вызывать патологические изменения в клетках.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1)Воробьев Л. И. Техническая микробиология. — М.: Высшая школа, 1987. — 94 с

2)Дебабов В. Г Лившиц В. А. Биотехнология. — М.: Высшая школа, 1988.

3)Егорова Н.С., Самуилова В.Д..- М.: Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов Высшая школа, 1987.

4)Лиеиньш Г. К. Дуце М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. — Рига: Зинатне, 1986. — 156 с.

5)Прищеп Т.П., Чучалин В.С., Зайков К.Л., Михалева Л.К.. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие – Ростов-на-Дону.: Феникс; Томск: Издательство НТЛ, 2006.

6)Сазыкин О.Ю. Биотехнология: учеб. пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. – 3-е изд., стер. – М. : Издательский центр «Академия», 2008.

7)Шмите И. А. Жилевич А. В. Биотехнология. — Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. — Рига: Зинатне, 1987. — 263 с.

8)www.rusbiotech.ru/spec/show.php?id=1719