Характеристика субстратов и сред, применяемых в фармацевтической биотехнологии

МИНИСТЕРСТВО  ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕТРОЗАВОДСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МЕДИЦИНСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

 

КАФЕДРА ФАРМАКОЛОГИИ, ОРГАНИЗАЦИИ И ЭКОНОМИКИ ФАРМАЦИИ

С КУРСАМИ МИКРОБИОЛОГИИ  И ГИГИЕНЫ

 

 

РЕФЕРАТ

Характеристика  субстратов и сред, применяемых в  фармацевтической 
биотехнологии.

 

 

 

 

Студента 4 курса

Группы 419

Минасян Луиза  Гариковной

 

Научный руководитель

кандидат биол. наук, доц. курса микробиологии

Сидорова Наталья Анатольевна

 

Дата сдачи 

Оценка

Подпись руководителя

 

 

 

 

 

Петрозаводск

2013

 

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

 

ГЛАВА 1. Характеристика основных видов сырья……………………………………………4-5                                                                       

 

ГЛАВА 2

  2.1 Субстраты для культивирования микроорганизмов с целью получения белка…6-7

  2.2. Компоненты питательных сред, применяемых в фарм. биотехнологии………..8-10

  2.3.Питательные среды и их характеристика                                                          11-14

ЗАКЛЮЧЕНИЕ                                                                                                                       15

ГЛОССАРИЙ                               

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                              

 

                                                         

                                                           Введение

Общий объем  биотехнологической продукции сегодня  в мире измеряется в миллионах  тонн в год. Любое производство начинается с сырья. Сырье в биотехнологических производствах, особенно крупнотоннажных, занимает первое место в статьях расходов и составляет 40-65% общей стоимости продукции.

 

Питательный субстрат, или питательная среда, является сложной трехфазной системой, содержащей жидкие, твердые и газообразные компоненты. 
 
Существует тесное взаимодействие между культивируемым объектом и физико-химическими факторами среды. В принципе, микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для промышленной биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ. 
Органическое сырье без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Тем не менее, целлюлозосодержащее сырье после химического или ферментативного гидролиза и очистки может быть использовано в биотехнологическом производстве. 
 
Из органического сырья наибольшее внимание биотехнологов привлекает крахмал, хотя для его ассимиляции микроорганизмами требуется сложный комплекс амилолитических ферментов, которыми владеют только некоторые виды микроорганизмов. Много крахмала расходуется для производства этанола, а также для приготовления фруктозных сиропов. Однако запасы крахмалсодержащего сырья ограниченны, поэтому используют мелассу, метанол, этанол и глюкозное сырье. При выборе сырья необходимо учитывать не только физиологические потребности выбранного продуцента, но и стоимость сырья. 
 
Углеродсодержащее сырье является основным сырьем микробного синтеза. К нему относятся парафиновые углеводороды нефти, метан как компонент природного газа, гидролизаты растительного сырья, этанол, уксусная кислота и т.д. Низкомолекулярные спирты (метанол и этанол) можно отнести к циклу перспективных видов микробиологического сырья, так как их ресурсы существенно увеличиваются благодаря успешному развитию технологии химического синтеза. Примером использования побочных продуктов является крахмальный экстракт, сульфитный щелок, зерновая и картофельная барда, меласса, молочная сыворотка и т.д.

 

ГЛАВА 1. Характеристика основных видов сырья.

Распространенными источниками углерода и энергии  являются компоненты нефти и природного газа. В состав сырой нефти входят парафиновые, нафтеновые и ароматические  углеводороды с большей или меньшей примесью кислородсодержащих или сернистых соединений. 
Дизельная фракция (продукт переработки нефти) содержит не менее 15% парафинов и является источником парафиновых углеводородов, которые по структуре и молекулярной массе оптимальны для потребления бактериями и дрожжами. 
 
Практически все сказанное о нефти относится и к природному газу - сложной смеси органических (углеводороды и их производные) и неорганических веществ. Концентрация метана в природном газе может приближаться к 100%. Вместе с тем круг метанотрофов - микроорганизмов, способных непосредственно утилизировать метан, сравнительно ограничен. 
 
Используемый природный газ требует перед подачей в ферментер дополнительной очистки от соединений, сильно ингибирующих рост клетки. Ограниченность ресурсов нефти и газа вынуждает биотехнологов изыскивать иные, в первую очередь возобновляемые источники сырья. 
 
В этой связи большое внимание уделяют различным видам растительной массы: плодам, сокам, клубням, травяной массе, древесине. Применяют отходы сельского хозяйства, деревообрабатывающей и бумажной промышленности, что позволяет реализовать с помощью биотехнологии принцип безотходного производства. 
 
Половину высушенной растительной биомассы составляет целлюлоза - самый распространенный биополимер. Как полисахарид целлюлоза представляет собой ценный источник углерода и энергии.

 

Химический состав растительного  сырья неодинаков. Главной частью растительного сырья являются полисахариды (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества) - 40-75% и лигнин- от 15 до 60%. Лигнин- нерастворимый при гидролизе остаток растительного сырья- находит ограниченное применение и является балластом. 
 
 
Основными недостатками процесса гидролиза древесины являются образование крупнотоннажного отхода - лигнина и низкое качество гидролизата с точки зрения микробиологического синтеза. 
 
В настоящее время интенсивно разрабатываются более совершенные процессы гидролиза растительного сырья. 
 
Перспективным направлением является ферментативный гидролиз целлюлозы. 
 
Основным источником этанола является нефтехимический синтез. 
 
Известны также промышленные способы получения других подобных продуктов. 
 
«Гидролизный спирт» получают путем сбраживания гексоз, содержащихся в гидролизатах растительного сырья. 
 
«Пищевой» этанол- образуется в процессе брожения моносахаридов при ферментативном гидролизе крахмала. Производство синтетического этилового спирта основано на сернокислотной гидратации этилена или прямой гидратации этилена водяным паром. Полученный этанол в виде азеотропа (96% этанола и 4% воды) с минимальным содержанием ингибирующих примесей (не более 0,005%) является готовым субстратом для культивирования микроорганизмов. 
 
В последние годы установлено, что уксусная кислота представляет собой очень перспективный субстрат для биотехнологии: на ней хорошо развиваются дрожжи как источник микробного белка, однако наиболее интересно применение уксусной кислоты в биосинтезе лизина. 
 
Пищевая уксусная кислота издавна получается путем окисления этанола культурами бактерии рода Acetobacter. 
 
Меласса, содержит до 50% сахарозы, является отходом сахарного производства и очень широко используется в микробиологическом синтезе, так как многие продуценты белка и биологически активных веществ прекрасно утилизируют углеводы из мелассы. 

ГЛАВА 2.

2.1. Субстраты для культивирования микроорганизмов с целью получения белка.

В качестве источников вещества и энергии микроорганизмы используют самые разнообразные  субстраты - нормальные парафины и дистилляты нефти, природный газ, спирты, растительные гидролизаты и отходы промышленных предприятий.  
 
Для выращивания микроорганизмов с целью получения белка хорошо бы иметь богатый углеродом, но дешевый субстрат. Этому требованию вполне отвечают нормальные (неразветвленные) парафины нефти. Выход биомассы может достигать при их использовании до 100% от массы субстрата. Качество продукта зависит от степени чистоты парафинов.  
Одним из перспективных источников углерода для культивирования продуцентов белка высокого качества считается метиловый спирт. Его можно получать методом микробного синтеза на таких субстратах, как древесина, солома, городские отходы. Использование метанола в качестве субстрата затруднено из-за его химической структуры: молекула метанола содержит один атом углерода, тогда как синтез большинства органических соединений осуществляется через двухуглеродные молекулы. На метаноле как на единственном источнике углерода и энергии способны расти около 25 видов дрожжей, в том числе Pichia polymorpha, Pichia anomala, Yarrowia lipolytica. Наилучшими продуцентами на этом субстрате считаются бактерии, потому что они могут расти на метаноле с добавлением минеральных солей. Процессы получения белка на метаноле достаточно экономичны.  
Использование этанола как субстрата снимает проблему очистки биомассы от аномальных продуктов обмена с нечетным числом углеродных атомов.  
 
В США, Японии, Канаде, ФРГ, Великобритании разработаны технологические процессы получения белка на природном газе. Выход биомассы в этом случае может составлять 66% от массы субстрата. Главные достоинства метана (кстати сказать, основного компонента природного газа) - доступность, относительно низкая стоимость, высокая эффективность преобразования в биомассу метаноокисляющими микроорганизмами, значительное содержание в биомассе белка, сбалансированного по аминокислотному составу. Бактерии, растущие на метане хорошо переносят кислую среду и высокие температуры, в связи с чем устойчивы к инфекциям.  
 
Субстратом для микробного синтеза может быть и минеральный углерод - углекислый газ.  
Наиболее перспективно получение белка с помощью водородоокисляющих бактерий, которые развиваются за счет окисления водорода кислородом воздуха. Энергия, высвобождающаяся в этом процессе, идет на усвоение углекислого газа. Для получения биомассы используются, как правило, бактерии рода Hydrogenomonas.  

Исключительно доступным и достаточно дешевым  источником углеводов для производства микробного белка является растительная биомасса. Любое растение содержит разнообразные сахара. Целлюлоза - полисахарид, состоящий из молекул глюкозы.  
 
Наиболее крупным производителем сырья для гидролизной промышленности являются деревообрабатывающие предприятия, отходы которых достигают ежегодно десятки миллионов тонн. К сожалению, нерационально или не используются вообще отходы производства лубяных волокон (из льна и конопли), картофелекрахмального производства, пивоваренной, плодоовощной, консервной промышленности, свекловичный жом.  
 
Особого внимания заслуживают способы прямой биоконверсии продуктов фотосинтеза и их производных в белок с помощью грибов. Эти организмы благодаря наличию мощных ферментных систем способны утилизировать сложные растительные субстраты без предварительной обработки. Исследования условий биоконверсии растительных субстратов в микробный белок активно ведутся в США, Канаде, Индии, Финляндии, Швеции, Великобритании, в нашей стране и других странах мира. Однако в литературе сведения о широкомасштабном производстве белков микробного происхождения немногочисленны.  

Лактоза молочной сыворотки может служить источником энергии для многих видов микроорганизмов, сырьем для производства продуктов микробного синтеза (органических кислот, ферментов, спиртов, витаминов) и белковой биомассыСпособность к ассимиляции лактозы имеется примерно у 20% всех известных видов дрожжей. Гораздо реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу. Активный катаболизм лактозы особенно характерен для дрожжей из рода Kluyveromyces. Эти дрожжи можно использовать для получения на молочной сыворотке кормового белка, этанола, препаратов β-глюкозидазы. 
 
Приведенный перечень микроорганизмов и процессов получения белка одноклеточных не является исчерпывающим. Однако потенциал этой новой отрасли производства используется далеко не полностью.

 

2.2. Компоненты питательных сред, применяемых в фарм. биотехнологии.

Азот. Микроорганизмы могут использовать как органические, так и неорганические источники азота. Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем большинство микромицетов, актиномицетов и дрожжей. У клеток животных и растений особые требования к источникам азота. Продуктивность по биомассе в зависимости от источника азота не всегда совпадает с продуктивностью целевого метаболита и зависит также от условий культивирования. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли -сульфат аммония, фосфат аммония, а также аммиак из водного раствора. Соли азотной кислоты не всегда хорошо усваиваются. Только некоторые виды дрожжей испытывают потребность в нитратах. Часто источником азота в состав сред включают мочевину. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимическая активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.).

Фосфор. Фосфор, как известно, входит в состав нуклеиновых кислот, фосфолипидов и других важных компонентов клетки. Иногда фосфор накапливается в ней в виде полифосфатов. Небольшая часть усвоенного фосфора существует в форме макроэргических соединений — АТР. Фосфор является важным компонентом клетки. 

Микроорганизмы нуждаются еще  в 10 минеральных элементах, но в значительно меньших количествах (10~3— 10~4М). Повышенная потребность микроорганизмов в микроэлементах возникает, если целевой метаболит содержит микроэлемент. Так, при биосинтезе витамина В12 в состав питательной среды включают кобальт; молибден и бор стимулируют биосинтез тиамина в клетках клубеньковых бактерий; медь присутствует в ряде ферментов, переносящих электроны от субстрата к кислороду. Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клеток. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательный потенциал. При добавлении в среду электролитов он снижается, и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Увеличение содержания К+ или Na+ до 500 мг/л уменьшает величину потенциала клеток до 10—12 мВ. Введение в среду 60— 80 мг/л Са2+, Fe2+ или Си2+, равно как и 5 мг/л Аl+3, может привести клетки в электронейтральное состояние. В отличие от бактерий дрожжи и мицелиальные грибы не перезаряжаются и не приобретают положительный потенциал. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мембраны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток.

Комплексные обогатители сред. Микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов, аминокислот, цитокининов и других биологически активных веществ. С наступлением эры антибиотиков и в связи с широким применением микроорганизмов в промышленности остро встал вопрос об экономически оправданных, сбалансированных по составу питательных средах. Эффективной добавкой оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. Кроме кукурузного экстракта в рецептуры сред промышленного микробного синтеза включают дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, гидролизат дрожжей, клеточный сок картофельных клубней, молочную сыворотку, экстракт пшеничных отрубей, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Иногда добавляют мясной и рыбный пептоны. Для культивирования животных клеток используют экстракт плаценты, плазму крови животных. Для выращивания клеток растений или мицелия высших грибов применяют экстракты тыквы, листьев хлопчатника, отвар слив и др.

Пеногасители.

Процессы пенообразования и  пеногашения играют важную роль при  аэробном глубинном культивировании микроорганизмов. При сбалансированных пенных режимах увеличивается межфазная контактная поверхность и достигается интенсивный массообмен между средой и аэрирующим воздухом. Вспенивание питательной среды, устойчивость пены и ее реологические свойства (поверхностное натяжение, поверхностная вязкость) зависят от состава среды (содержания сахаров, липидов, белков, структурообразующих солей), режимов стерилизации и аэрации среды и пр. Для создания устойчивых режимов пенообразования применяют механические и химические пеногасители и их комбинации. Химические пеногасители (поверхностно-активные вещества -ПАВ) делятся на жировые и синтетические. Жиры проявляют пеногасящие свойства в относительно высоких концентрациях (0,2—1,0% от объема среды и выше). Кроме того, для многих микробиологических процессов они являются необходимыми или дополнительными питательными компонентами. При ассимиляции жиры, расщепляясь до жирных кислот, изменяют рН среды. Весьма эффективны синтетические пеногасители, (силиконы, пропинолы, контрамин, полиформаль и др.), выпускаемые для пищевой промышленности. В каждом конкретном процессе микробного синтеза экспериментальным путем подбирают оптимальный пеногаситель и рассчитывают его максимально допустимую дозировку.

Флокулянты. В некоторых микробиологических процессах целесообразно стимулировать флокуляцию (конгломеризацию) клеток продуцента, например, для более эффективного фракционирования клеток или с целью удерживания клеток в условиях непрерывной ферментации. Применяют химические флокулянты (хлорид кальция, соли фосфорной кислоты) или синтетические полиэлектролиты, которые могут быть анион-или катионактивные, или неионогены. На выпадающем в осадок фосфате кальция, например, адсорбируются клетки продуцента. Из анионактивных полиэлектролитов используют сополимер акриламида и натриевой соли акриловой кислоты. Катионактивные полиэлектролиты (например, цетазолакриламид с сополимером - катионогенным мономером) осаждают белковые вещества ферментируемой среды (до 20 г на 1 г полиэлектролита) и на них адсорбируются клетки. Эффективность применения флокулянтов во многом зависит от температуры культивирования, рН среды и физиологического состояния клеток.