Характеристика антибиотиков, краткая история их возникновения

3.2. Получение и  хранение взвеси клеток тест-культур

    Тест-культурами  служат  вегетативные  формы спорообразующих и

неспорообразующих   культур, обладающих высокой чувствительностью к антибиотикам.

    Музейные штаммы  вегетативных форм тест-культур хранят в столбике полужидкого (0,4%) питательного агара.

Вначале тест-культуру рассевают  на чашки с 2%-ным мясопептонным агаром для получения отдельных колоний. Чашки ставят в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 20 +/- 3 ч. После чего мелкие колонии отсеивают в пробирки с 2%-ным мясопептонным скошенным агаром и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 20 +/- 3 ч.

Микробную взвесь готовят  путем смыва физиологическим  раствором суточной культуры со скошенного агара. Важно, чтобы смыв культур был абсолютно гомогенным и не содержал комочков. Полученную взвесь хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °С не более 7 дней.

3.3. Определение  "рабочей дозы" тест-культур

Поскольку количество жизнеспособных клеток тест-культуры от смыва к смыву варьирует, предварительно необходимо определить "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. наибольшее разведение суспензии, вызывающее обесцвечивание метиленового синего в определенное время в термостате при температуре (37 +/- 1) °С. Следует учитывать, что время обесцвечивания метиленового синего обратно пропорционально количеству клеток в смыве.

Для постановки реакции выбрано  время обесцвечивания, равное 1 ч. Это  время, будучи величиной постоянной, выявляет в суспензиях различной  плотности одну и ту же клеточную  нагрузку для каждой тест-культуры в отдельности. "Рабочую дозу" тест-культур устанавливают по дегидрогеназной активности клеток.

3.4. Количественное  определение концентрации антибиотиков  и расчет активности

При определении концентрации антибиотика в пищевых продуктах  параллельно ставят контрольный  ряд с известным содержанием  антибиотика в пробирках. Для  этого навеску стандарта антибиотика (1 мг) растворяют в 1 мл соответствующего буфера, получая, таким образом, основной раствор стандарта 1000 мкг/мл. Затем  основной раствор десятикратно разводят до получения 100 мкг/мл и 10 мкг/мл. Далее  концентрации, с которых начинается титрование стандарта в контрольном  ряду (2,0; 1,0; 0,5 мкг/мл и т.д.), разводят соответствующими буферными растворами.

Титрование стандарта  антибиотика и испытуемых образцов проводят путем двукратных разведений в объеме 0,5 мл мясопептонного бульона. Последняя пробирка в контрольном  ряду не содержит антибиотик и служит контролем дегидрогеназной активности клеток тест-культуры.

После этого во все пробирки вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры, т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее обесцвечивание метиленового синего через 1 ч. В результате микробная нагрузка в пробирках уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.

Пробирки встряхивают  и помещают в термостат при  температуре (37 +/- 1) °С на 3-часовую экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок вновь смешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в термостате.

Если в исследуемом  объекте содержится антибиотик, то он блокирует дыхательные ферменты бактериальных клеток тест-культур и вызывает их гибель. В этих пробирках метиленовый синий не обесцвечивается (синий).

О степени активности антибиотика  судят по его минимальной концентрации, которая вызывает полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культур через 1 или 2 ч инкубации в термостате при температуре (37 +/- 1) °С по сравнению с контролем.

3.5. Определение  концентрации антибиотиков в  испытуемом растворе

Параллельно ставят второй ряд с двукратными разведениями испытуемого субстрата в пробирках  с заранее разлитым мясопептонным  бульоном в объеме 0,5 мл. Во все пробирки этого ряда также вносят 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры (т.е. предпоследнее разведение тест-культуры, вызывающее полное обесцвечивание метиленового синего через 1 ч инкубации в термостате). В результате микробная нагрузка уменьшается вдвое и соответствует "рабочей дозе" тест-культуры.

Таким образом, 1-я пробирка каждого ряда, контрольного и испытуемого, начинается с разведения 1:4.

Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.

Пробирки встряхивают  и помещают в термостат на 3-часовую  экспозицию тест-культуры с антибиотиком. Затем для создания условий, близких к анаэробным, в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1%-ного мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С.

Учет результатов производят по тесту подавления антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культуры через 1 или 2 ч инкубации в термостате.

Концентрацию антибиотика  в исследуемом субстрате с  неизвестным его количеством  вычисляют путем умножения последнего разведения субстрата, подавляющего дегидрогеназную активность тест-культуры (табл. 3), на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект (табл. 2).

Как видно из табл. 2, последнее  разведение стандарта бензилпенициллина вызывает полное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры, по сравнению с контролем, только через 2 ч инкубации в термостате и составляет 0,07 ЕД/мл. Через 1 ч инкубации антибиотик вызывает лишь частичное подавление дегидрогеназной активности клеток.

Таким образом, концентрация пенициллина, вызывающая полное подавление дегидрогеназ клеток тест-культуры, соответствует 0,07 ЕД/мл через 2 ч инкубации в термостате при температуре (37 +/- 1) °С.

Учесть результат в  данном опыте возможно только через 2 ч инкубации по полному подавлению дегидрогеназной активности клеток тест-культуры, которое наблюдается в разведении 1:8, так как через 1 ч инкубации испытуемый субстрат вызывает лишь частичное подавление активности дыхательных ферментов тест-культуры по сравнению с контролем (табл. 3).

Содержание пенициллина  в исследуемом субстрате вычисляют, умножив последнее разведение субстрата, подавляющее дегидрогеназную активность клеток тест-культуры, на минимальную концентрацию антибиотика контрольного ряда стандарта, вызывающего тот же эффект, т.е. 0,07 х 8 = 0,56 ЕД/мл. Таким образом, в испытуемом субстрате содержится 0,56 ЕД/мл пенициллина.

3.6. Качественное  определение антибиотиков

Качественное определение  антибиотиков в пищевых продуктах  можно проводить по вышеописанной  методике (3.5).

3.6.1. Проведение анализа.

Подготовленные к исследованию испытуемые пробы (см. 3.1.1) в объеме 0,5 мл вносят в пробирки с таким же (0,5 мл) количеством мясопептонного бульона и тщательно перемешивают. Во все пробирки добавляют 0,5 мл взвеси, содержащей двойную "рабочую дозу" тест-культуры.

Последняя пробирка не содержит испытуемого субстрата и служит контролем ферментативной активности тест-культуры.

Пробирки встряхивают  и помещают в термостат на 3-часовую  экспозицию тест-культуры с испытуемым субстратом.

После этого в каждую пробирку вносят по 2 мл растопленного и охлажденного до (45 +/- 1) °С мясопептонного агара с метиленовым синим и глюкозой. Содержимое пробирок смешивают и вновь инкубируют в термостате при температуре (37 +/- 1) °С в течение 1 - 2 ч.

3.6.2. Учет результатов.

1. При отсутствии в  испытуемых образцах антибиотика  дыхательные ферменты бактериальных  клеток тест-культур не нарушаются и восстанавливают (т.е. обесцвечивают) в анаэробных условиях метиленовый синий.

2. В контрольной пробирке, где нет испытуемого образца,  также происходит обесцвечивание  в течение 1 - 2 ч наблюдения  в термостате при температуре  (37 +/- 1) °С (контроль ферментативной  активности бактериальных клеток  тест-культуры).

3. При наличии антибиотика  в испытуемом образце дыхательные  ферменты бактериальных клеток  блокируются, метиленовый синий  не восстанавливается и пробирки не изменяются, цвет их остается синим.

4. Параллельно в качестве  второго контроля можно использовать  субстраты, содержащие определенную  концентрацию антибиотика.