Характеристика антибиотиков, краткая история их возникновения

Температура в период первой фазы должны быть 30 °С, во вторую фазу 20 °С, рН в период роста гриба - ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы.

Синтез того или иного пенициллина  зависит от наличия специфичного вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который микроорганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина (фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых концентрациях и рН среды оказывают токсическое влияние на продуцента. Фенилуксусная кислота наименее токсична. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия, особенно в первые 24 ч его развития. Фенилуксусная кислота добавляется в концентрации от 100 до 500 мкг/мл через 24 ч развития P. chrysogenum, При таких условиях обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч развития может достигать 500—1000 мкг/мл.

При развитии гриба без  внесения предшественника образуется около 45% бензилпенициллина (пенициллин G) и около 53% пенициллина К (радикал - и-гептилпенициллин). При добавлении к среде фени- луксусной кислоты (C6H5CH2COOH) меняется соотношение образующихся компонентов в сторону резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает 75-99% от смеси пенициллинов. В процессе культивирования P. chrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не Р-лактамного характера, близкие к цистеину и метионину.

Добавление в среду фенилуксусной  кислоты способствует более интенсивному метаболизму серосодержащих компонентов в соединения Р-лактамного характера.

При развитии продуцента пенициллинов - гриба P. chrysogenum - на кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы.

Первая фаза - рост мицелия, выход  антибиотика низок. Всегда присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно. Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН.

Вторая фаза - максимальное образование  пенициллина, это связано с быстрым  потреблением лактозы и аммонийного  азота. рН среды остаётся почти без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление кислорода снижается.

Третья фаза - снижение концентрации антибиотика в среде в связи  с начавшимся автолизом мицелия  и выделением в результате этого  процесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.

В настоящее время описано шесть  условно выраженных возрастных фаз  продуцента пенициллина. Заметное количество пенициллина начинает образовываться с IV возрастной фазы гриба, максимум накопления приходится на VI фазу - в период автолиза.

Определение возрастных фаз путём  микроскопического контроля позволяет установить: 1) ход общего темпа развития гриба, его состояние, пригодное для использования посевного материала, контроль за ходом образования антибиотика; 2) дефекты развития и возможные причины этих дефектов; 3) момент окончания развития гриба в реакторе.

По мере развития гриба меняется и химический состав мицелия. Количество общего азота и белка в мицелии  уменьшается, содержание моносахаров в период максимального биосинтеза пенициллина (96 ч) увеличивается почти в 6 раз по сравнению с начальным периодом, количество дисахаридов уменьшается. Изменяется количество отдельных аминокислот.

Процесс биосинтеза пенициллина  ведётся при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур  посторонней микрофлорой резко  снижает накопление антибиотика.

Современная промышленная микробиология  получает культураль- ные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл. Выделение пенициллина начинается с фильтрации или центрифугирования (отделения мицелия гриба).

Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислОты, выделяют путём экстракции неполярными органическими растворителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутано- лом и др.). Очистку антибиотика проводят путём замены растворителей, поскольку соли пенициллина плохо растворимы в органических растворителях. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щёлочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых или калиевых солей. Новокаиновые и бен- затиновые соли являются основой пролонгированных препаратов пенициллина для внутримышечного введения.

В сухой кристаллической форме  пенициллиновые соли достаточно стабильны  в течение длительного времени  при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 часов при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением.

В настоящее время большое практическое значение имеет полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина. Исходным продуктом служит 6-аминопени- циллановая кислота (6-АПК).

6-АПК получают в результате  биосинтеза при развитии P. chrysogenum при отсутствии предшественника в среде или путём ферментативного дезацилирования бензилпенициллина или феноксиметилпени- циллина при участии фермента пенициллииацилазы (пенициллинамида- зы). Второй способ наиболее перспективен. Используется иммобилизованная пенициллинацилаза, которая гидролизует бензилпенициллин с образованием 6-АПК и фенилуксусной кислоты. Пенициллинацилаза образуется различными группами микроорганизмов, в том числе она образуется всеми продуцирующими пенициллин грибами. В настоящее время предложен способ получения иммобилизованных клеток Е. coli с высокой пенициллинацилазной активностью, пригодных для многократного применения.

Сама по себе 6-АПК не активна. Её подвергают химическому аци- лированию и получают аналоги пенициллина с улучшенными или новыми свойствами; некоторые из них: оксациллин, ампициллин, мети- циллин, амоксициллин и другие. Всего в настоящее время используется порядка четырёх десятков таких препаратов.

В настоящее время бензилпенициллин необходим не только как медицинский препарат, но и как вещество, являющееся исходным продуктом для получения 6-АПК и в дальнейшем полусинтетических пени- циллинов. Из общего количества природных пенициллинов примерно 35% используется как медицинские препараты, а 65% - для получения 6-АПК.

В начале 60-х гг. были предприняты  попытки химического синтеза  пенициллинов, в частности был  синтезирован феноксиметилпеницил- лин, но практического значения эти попытки не имели.

Цефалоспорин - антибиотик из грибов рода Cepholosporium. Основным продуцентом является С. acremonium.

Впервые сообщение было сделано  Джузеппе Бротцу в 1948 г. В культуральной жидкости было обнаружено несколько цефалоспоринов, основной из которых - цефалоспорин С. На основе этого антибиотика в дальнейшем были созданы многочисленные полусинтетические цефа- лоспорины с ценными свойствами.

В процессе развития С. acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина. Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С.

Все пенициллины и цефалоспорины являются селективными ингибиторами синтеза клеточной стенки. Первый этап действия препаратов заключается в их связывании с клеточными рецепторами; такими рецепторами являются пенщиллинсвязывающие протеины (ПСП), количество которых составляет от 3 до 6 тыс. у различных бактерий. Отдельные ПСП могут иметь неодинаковый аффинитет к препарату, и каждый из них может опосредовать различное действие. Так, присоединение пенициллина к одному ПСП может вызывать аномальное увеличение клетки, присоединение к другому - приводить к дефекту на поверхности клеточной стенки без последующего лИзиса клетки. ПСП контролируется хромосомами, мутации могут изменить их количества и аффинитет к отдельным р-лактамным препаратам. После связывания /?- лактамнного препарата с рецепторами ПСП ингибируется реакция транспепдидирования и останавливается синтез пептидогликана. Следующий этап - устранение или инактивация ингибитора аутолити- ческих энзимов (гидролаз) в клеточной стенке, что сопровождается активизацией литического фермента у некоторых микроорганизмов и может привесите к лизису клетки.

В последние годы методом  смешанного (биологического и химического) синтеза удалось получить около 50 тыс. аналогов цефалоспорина. Примерно 50 антибиотиков имеет практическое клиническое значение. Цефалоспорины традиционно делят на четыре поколения по спектру действия и антимикробной активности.

Сущность метода

Ускоренный метод качественного  и количественного обнаружения  антибиотиков в пищевых продуктах  и других субстратах, основан на подавлении антибиотиком дегидрогеназной активности тест-культур в жидкой питательной среде.

Дегидрогеназы-ферменты активируют процессы дыхания в живой клетке. Повреждение дегидрогеназ приводит к нарушению окислительно-восстановительных процессов и гибели клетки.

Высокая чувствительность этих ферментов к неблагоприятным  воздействиям использована для выявления  повреждающего действия антибиотика  на различные тест-культуры. В методе используется способность клеток тест-культур восстанавливать метиленовый синий в анаэробных условиях. Если антибиотик оказывает цитотоксическое действие, клетки тест-культур лишаются такой возможности и метиленовый синий не восстанавливается. Метиленовый синий играет в этой системе одновременно роль акцептора водорода и индикатора, позволяющего судить о повреждающем действии антибиотиков на клеточные дегидрогеназы за определенный отрезок времени.

Преимущество экспресс-метода заключается в возможности получения  ответа через 4 - 5 ч, относительной простоте и значительной экономии питательной  среды.

Допустимое содержание антибиотиков в продуктах не должно превышать  для тетрациклинов 0,01 ЕД, пенициллина 0,01 ЕД, для стрептомицина 0,5 ЕД на 1 г (мл) продукта. (2)

Метод состоит из нескольких этапов:

1. Подготовка проб к  исследованию при качественном  и количественном определении.

2. Получение и хранение  взвеси клеток тест-культур.

3. Определение "рабочей  дозы" тест-культур.

4. Определение концентрации  антибиотиков и расчет активности.

5. Определение концентрации  антибиотиков в испытуемом растворе.

6. Качественное определение  антибиотиков.

 

Этапы исследования

3.1. Подготовка  проб к исследованию при качественном  и количественном определении

3.1.1. Подготовка проб к  исследованию при качественном  определении.

Молоко и сливки жидкие (в сыром или пастеризованном  виде)

Сырое молоко желательно подвергать исследованию в день отбора, как  можно быстрее после получения (отбор на фермах);

до начала анализа сохранять  в холодильнике при температуре (4 +/- 1) °С. Пробу в объеме не менее 10 см переносят в пробирку.

Сухие молочные продукты (сухое  молоко, сухие сливки, сухие детские  молочные продукты, изготовленные на основе коровьего молока)

Непосредственно перед исследованием  продукты подвергаются восстановлению в кипяченой воде при температуре  не выше (45 +/- 1) °С в соответствии с  указаниями на этикетке. Образцы тщательно перемешивают, они не должны содержать нерастворенных частиц или комков. Из восстановленного продукта отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 куб. см.

Яйца, меланж

Яйца, предназначенные для  исследования, предварительно прогревают на водяной бане при температуре (65 +/- 1) °С в течение 10 - 15 мин до коагуляции белка, затем полностью смешивают содержимое яйца, от которого отбирают пробы для анализа в объеме не менее 10 куб. см.

Мясо и субпродукты

Мясо и субпродукты (печень, почки, язык и т.д.) скота и птицы, предназначенные для исследования, измельчают при помощи мясорубки  или гомогенизатора, помещают полученный фарш в чашку Петри и дают стечь  тканевому соку. Тканевый сок в  объеме не менее 10 куб. см переносят в пробирку.

Термическая обработка проб пищевых продуктов

Перед проведением исследования пробирки с отобранными пробами (см. п. 3.1.1) помещают в водяную баню с температурой (60 +/- 1) °С. Параллельно с испытуемыми образцами в водяную баню помещают пробирки с аналогичным продуктом и термометром. Время прогревания - 30 мин. - отмечают от момента достижения температуры внутри пробирки.

3.1.2. Подготовка проб к  исследованию при количественном  определении.

Молоко, молочные продукты и  яйца

Для определения концентрации антибиотика в молоке, жидких молочных продуктах, кроме кисломолочных, яйцах  пробы, подготовленные к исследованию (см. п. 3.1.1) в количестве 10 мл или 10 г (смешанного содержимого каждого  яйца) вносят в колбы емкостью 50 мл и добавляют равное количество (10 мл) буферного раствора соответственно определяемому антибиотику: при  определении тетрациклина - цитратно-соляно-кислый буфер N 2; стрептомицина или пенициллина - фосфатный буфер N 4 и N 1 соответственно. Таким образом, получают пробы для исследования, разведенные в 2 раза.

Мясо и мясные продукты

Навески по 10 г мышечной ткани, почки, печени, легкого и т.д., вырезанные из средней части образца, измельчают ножницами или микроразмельчителем тканей с последующим растиранием в ступке со стерильным кварцевым песком. Затем в ступку добавляют 10 мл соответствующего буфера, тщательно перемешивают и переносят в центрифужные пробирки. Экстракцию антибиотика проводят в течение 90 мин. в термостате при температуре (37 +/- 1) °С. Затем пробы прогревают на водяной бане при температуре (65 +/- 1) °С 30 мин. и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 мин. Из надосадочной жидкости, являющейся первым разведением 1:2, берут 1 мл и прибавляют 1 мл соответствующего буфера, получают второе разведение 1:4 и т.д. Концентрацию антибиотика определяют в надосадочной жидкости, полученной от каждого образца мяса и мясных продуктов.