Генетика мікроорганізмів. Методи біотехнології та генної інженерії

Реплікація ДНК по сігма-типі здійснюється через проміжну структуру, що нагадує грецьку букву сигма, відкіля і назва цього типу. Цей тип реплікації спостерігається  в процесі кон'югації бактерій і  деяких фагів. При цьому типі реплікації відбувається добудовування обох ниток  ДНК до дволанцюгової ДНК.

Геном бактерій виконує наступні функції: забезпечує передачу біологічних  властивостей; програмує синтез бактеріального білка з визначеними властивостями; бере участь у процесах мінливості бактерій; забезпечує збереження індивідуальності виду; детермінує множинну стійкість до ряду лікарських речовин.

 

 

Розділ 2. Генетичні  процеси в клітинах мікроорганізмів

 

2.1 Генетичні рекомбінації  у бактерій: трансформація, конюгація, трансдукція

 

У процесі еволюції природний  добір діє не тільки на рівні мутацій в окремих генах, але і на рівні рекомбінації генів, в результаті якої із ДНК двох різних клітин утворюється рекомбінантна хромосома. Цей процес називається генетичною рекомбінацією, а клітини, які утворюються в результаті цього процесу -- рекомбінантами. При рекомбінації не проходитьповне злиття клітин (не утворюються диплоїди), а частина генетичного матеріалу донорної клітини переноситься в реціпієнтну клітину, яка стає частковим диплоїдом або мерозиготою. В рекомбінантній хромосомі основу складає хромосома клітини - реціпієнта, яка включає частину клітини - донора, рекомбінанти формуються в реціпієнтних клітинах.

До рекомбінативної мінливості генетичного матеріалу, приводить  трансформація, трансдукція і кон`югація. Рекомбінативна мінливість належить до другого типу спадкової мінливості (після мутаційної).

Тансформація (лат. transformatio - перетворення) передача генетичного  від донора до реціпієнта за допомогою ізольованої ДНК. При трансформації не потрібен безпосередній контакт між клітиною-донором і клітиною-реціпієнтом. Джерелом трансформуючої ДНК може служити вбита культура бактерій (свіжа), або чисті препарати ДНК, які з неї екстраговані.

Явище тренсформації у  бактерій вперше спостерігав Ф. Гриффітс в 1928 р., але він його не пояснив. Пізніше в 1944 р. О.Евері, К.Мак-Леод і М. Мак-Карті вдалося виділити трансформуючий агент і встановити його хімічну природу. Трансформуючим агентом виявилася ДНК. Процес трансформації проходить у декілька етапів: 1) адсорбція трансформуючої ДНК на поверхні клітини реціпієнта; 2) проникнення ДНК в клітину; 3) з`єднання трансформуючої ДНК з відповідним фрагментом хромосоми реціпієнта.

Не всі клітини бактерій здатні сприймати ДНК. Клітини, які  сприймають трансформуючу ДНК, називаються  компетентними.

Явище трансформації виявлино у стафілококів, бацил, бульбочкових бактерій, агробактерій, бруцел та ін. Число таких видів перевищило 50, але найкраще вона вивчена у  сінної палички і стрептококу  пневмонії. Вчені вважають, що можлива  і міжвидова трансформація, але  це спостерігається тоді, коли ДНК  донора і реціпієнта подібні за нуклеотидним складом-гетеротрансформація. Гомотрансформація - перенесення генетичної інформації від одного штаму бактерій до другого (в межах одного виду). Відкриття явища трансформації дало змогу встановити роль нуклеїнових кислот як носіїв спадкової інформації.

За характером розміщення перенесених ознак розрізняють  зчеплену трансформацію - перенесення  двох і більше генів, які розміщені поруч, одним фрагментом ДНК.

Незчеплена тренсформація - перенесення генів різними фрагментами ДНК, або одним, Але гени не розміщені поруч.

В результаті трансформації  утворюються трансформанти, які  мають ознаки донора і реціпієнта. Рекомбінантна ДНК далі реплікується як єдина структура. Трансформація може здійснюватися як в лабораторних умовах так і в природі. Трансформацію в бактерій використовують для проведення гібридологічного аналізу різних мутацій, для встановлення філогенетичної подібності донора і реціпієнта.

Кон'югація (лат. conjugatio спряження  бактерій) - передача генетичного матеріалу  від однієї клітини до другої шляхом безпосереднього контакту між ними.Вперше була вивчена в 1946 р. Дж. Ледербергом і Е. Татумом при культивуванні кишкової палочки.

Пізніше було показано, що між кон'югуючими клітинами утворюється цитоплазматичний мостик і втановлено наявність статевої деференціації. При кон'югації одна бактерія є донором -- чоловіча клітина F⁺ (анг. fertility -- плодючість), друга -- реціпієнтом -- жіноча клітина F--.

Статева диференціація зумовлена  статевим фактором (F фактор), який є  лише в чоловічих клітинах. Статевий фактор -- це дволанцюгова ДНК, яка має форму кільця. Вона зумовлює ряд властивостей чоловічих клітин -- наявність статевих ворсинок F-пілі, спецефічну чутливість клітин-донорів до “чоловічих” дрібних РНК і ДНК-вмісних фагів. За допомогою статевих ворсинок чоловіча клітина прикріпляється до жіночої і через їх канальці відбувається перенесення генетичного матеріалу. Якщо схрещувати між собою жіночі клітини, то рекомбінанти не утворюються.

Статевий фактор може існувати в клітині автономно (поза хромосомою). Його відносять до групи бактеріальних плазмід. Але поряд з цим, існують клітини, в яких статевий фактор інтегрований з хромосомою. Такі плазміди дістали назву епісом -- і клітини називаються Hfr - клітинами (висока частота рекомбінації -- 10 --3).

Під час кон'югації при передачі ДНК від донора до реціпієнта зберігається цілісність генома донорної клітини. В клітину реціпієнта переноситься одноланцюгова ДНК донора під впливом якої в клітині синтезується комплементарний ланцюг і відновлюється дволанцюгова ДНК. Завершується кон'югація утворенням рекомбінантної бактеріальної хромосоми.

Кон'югація може відбуватися  між штамами одного виду, між представниками різних видів. Це приводить до утворення так званих міжвидових рекомбінантів.

Трансдукція -- процес перенесення генетичного матеріалу від однієї бактеріальної клітини до другої за допомогою бактеріофага. Відкрив в 1952 р. Н. Ціндер і Дж.Ледерберг на прикладі двох штамів сальмонел.

Трансдукцію здійснюють помірні  фаги та їх вірулентні мутанти.Суть трансдукції полягає в тому, що деякі помірні фаги в процесі репродукції включають у свій геном невеликі фрагменти ДНК бактерії-донора і переносять їх до бактерій-реціпієнтів.

Фаги діляться на вірулентні і помірні. Вірулентні фаги, проникають в клітину, зумовлюють формування нових  фагів і лізис бактерій. Зараження клітин помірними фагами не завжди супроводжується лізисом бактерій, частина їх виживає і стає лізогенними. В лізогенних бактеріях ДНК фага включається в ДНК клітини і помірний фаг перетворюється в профаг, який втрачає здатність руйнувати бактеріальну клітину. Профаг поводить себе так, як частина бактеріальної хромосоми і відтворюється в її складі протягом декількох поколінь.

У бактерій розрізняють 3 типи трансдукції: загальну, специфічну і  абартивну.

При загальній трансдукції  проходить передача різних фрагментів ДНК від бактерій-донорів до бактерій-реціпієнтів за допомогою помірних трансдукуючих фагів.

Специфічна трансдукція  характеризується здатністю фага переносити від бактерій донорів до бактерій реціпієнтів тільки певні гени. Це зумовлено тим, що утворення трансдукуючого фага проходить в результаті з'єднання його ДНК із строго визначеними бактеріальними генами, розміщеними на хромосомі клітини донора.

При абортивній трансдукції  перенесений фагом фрагмент хромосоми  клітини-донора не включається в  хромосому клітини-реціпієнта, а розміщується в її цитоплазмі автономно. В процесі поділу клітини-реціпієнта трансдукований фрагмент ДНК-донора може передаватися тільки одній із двох дочірних клітин, тобто успадковується однолінійно, в зв'язку з чим втрачається в потомстві.

 

2.2 Регуляція генної  активності

 

Функціональна нерівнозначність кліток і зв'язана з нею репресія й активація генів давно привертали увагу генетиків.

Перша спроба пояснити регуляторну  активність генів були зв'язані з  вивченням гістонних білків. Ще чоловік  і жінка Стедман на початку 40-х  років нашого століття одержали перші  чіткі результати про розходження  в хімічній природі гістонних  білків. Подальші дослідження показали, що регуляція генної активності набагато більш складний процес, ніж простої взаємодія ділянок генів з молекулами пістонних білків.

Жакоб і Моно розділили  гени регуляторної системи на два  типи - гени-регулятори і гени-оператори. Автори ввели в генетику нове поняття, визначивши блок структурних генів  і керуючий ними оператор як єдину  функціональну одиницю - оперон.

В останні роки були отримані дані про наявність ще одного керуючого  осередку генної активності-промоторі. Виявилося, що по сусідству з операторною ділянкою, до якого приєднується продукт - білкова речовина репресор, синтезований на гені-регуляторі, мається інша ділянка, що відноситься до членів регуляторній системі генної активності. До цієї ділянки приєднується молекула ферменту РНК- полімерази. У цій промоторній ділянці повинне відбутися взаємне дізнавання унікальної послідовності нуклеотидов у ДНК і специфічній конфігурації білка РНК- полімерази. Від ефективності дізнавання буде залежати здійснення процесу зчитування генетичної інформації з даної послідовності генів оперона, що примикає до промотору.

 

2.3 Позахромосомні фактори спадковості

 

До позахромосомних факторів спадковості відносять плазміди і епісоми, що розташовуються в цитоплазмі клітини. Плазміди не здатні вбудовуватися в нуклеотид бактерії, вони мають власну ДНК, що може самостійно реплікуватися. На противагу плазмідам, епісоми вбудовуються в нуклеотид бактерії і функціонують разом з ним.

Плазміди, не залежно від  нуклеотиду, забезпечують здатність  до коньюгации, стійкість до антибіотиків і інших речовин. Установлено, що наявність плазмид у клітці не обов'язково, але в теж час їх може бути кілька. Плазміди підрозділяють на кон`югативні (трансмісивні) і некон`югативні (на трансмісивні). Перші - додають клітині властивості генетичного донора, детермінують перенос генетичного матеріалу від клітки донора до клітини реципієнтові, другі - не додають клітині властивостей генетичного донора, не можуть передаватися до клітини реципієнта без наявності факторів переносу.

Розрізняють наступні види плазмід: Соl-фактор - коліциногенний фактор, F-фактор - фактор фертильності, R-фактор - фактор стійкості до лікарських речовин, плазміди біодеградації, плазміди, що кодують фактори вірулентності в мікроорганізмів (Ent, Hly, Sal, K і т.д.)

Col-фактори - це плазміди, що контролюють синтез бактеріоцинів,  що володіють здатністю пригнічувати  розвиток філіпченкових родинних бактерій. Назва бактеріоциногенів привласнюють з урахуванням виду мікроорганізмів їхній продуцирующих. В даний час відомо, що практично майже всі патогенні бактерії продукують бактеріоцини.

Бактеріоцини кишкової палички  називають коліцини, стафілокока - стафілоцини, пневмокока - пневмоцини, вібріона - вібріоцини і т.д.. Краще інших бактеріоцинів вивчені коліцини. Культури кишкової палички, продукуючі коліцини, називають коліциногенами, а чуттєві до них - коліциночутливими. Коліцини - речовини білкової природи. Вони мають здатність ингибировать синтез ДНК, РНК, білка, викликати загибель клітки не порушуючи її цілісності. Коліцини мають летальну ознаку, тобто після їхньої продукції бактеріальна клітка може загинути. Коліцини функціонують аналогічно антибіотикам з вузьким спектром дії, мають властивості ендодезоксирибонуклеаз.

Бактеріальні клітини, що виділяють бактерицини, стійкі до дії гомологічних бактерицинів навколишнього середовища.

F-фактор може функціонувати  автономно і може бути в  інтегрованому, як епісома, стані. Цей фактор являє собою кільцеву ДНК довжиною 30-32 нм, молекула якої детермінує перенос генетичного матеріалу з клітки донора в клітку реципієнта, синтез полових ворсинок, синтез ферментів, здатність до автономної реплікації і т.д.

R-фактор генетична структура,  що забезпечує стійкість до лікарських препаратів. Ця структура несе гени лікарської стійкості (год-гени). Стійкість до одному або декільком лікарським препаратам (антибіотикам) здійснюється за рахунок оперонів і може бути передана шляхом кон'югації і трансдукції.

Плазміди біодеградації  відповідальні за використання органічних сполук бактеріями як джерела вуглецю  й енергії, за утилізацію ряду цукрів, утворення протеолітичних ферментів.

Ent-плазміди кодують утворення  ентеротоксинів у ентеробактерій, Hly-плазміда - синтез гемолізинів у ентеропатогенних мікроорганізмів і стрептококів. Sal-плазміда контролює в псевдомонад використання бактеріями саліцилатів завдяки виробленню призначеного для цієї мети ферменту.

 

2.4 Використання  на практиці досягнень генетики  мікроорганізмів

 

Досягнення генетики мають  важливе значення в сільському господарстві, промисловому виробництві і в  медицині. Внаслідок утворення індукованих  мутантів можна отримати в десятки  і сотні разів більше цінних продуктів (антибіотиків, ферментів, вітамінів, амінокислот) в порівнянні з дикими формами  мікроорганізмів.