Доказательства роли ДНК в наследственности

 

 

 

11

Репликация (удвоение) ДНК. ДНК находится в хромосомах, и репликация ее происходит перед  каждым удвоением хромосом и делением клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили схему удвоения ДНК, согласно которой спиралевидная двухцепочная ДНК сначала раскручивается (расплетается) вдоль оси. При этом водородные связи между азотистыми основаниями рвутся и цепи расходятся. Одновременно к нуклеотидам каждой цепи пристраиваются комплементарные азотистые основания нуклеотидов второй цепи, где против аденина встает тимин, против тимина — аденин, против гуанина — цитозин и т. д., которые с помощью ферментов ДНК-полимераз связываются в новые полинуклеотидные цепи. В результате из одной образуются две новые дочерние молекулы ДНК. Каждая дочерняя молекула, наследуя структуру одной цепи материнской молекулы, строго сохраняет специфичность заключенной в ней информации. Поскольку матрицей для репликации служит одна из двух цепей молекулы, такой тип синтеза ДНК носит название полуконсервативной ауторепродукции.

 

Удвоение хромосом эукариотов является сложным процессом, поскольку включает не только репликацию гигантских молекул ДНК, но также и синтез связанных с ДНК гистонов и негистоно-вых хромосомных белков. Конечным этапом является упаковка ДНК и гистонов в нуклеосомы. Считают, что удвоение хромосом также имеет полуконсервативный характер.

Репликационное  поведение хромосом основывается на трех фундаментальных свойствах, а  именно: непосредственно репликация, сегрегация хромосом при репликации ДНК и делении клеток, а также  репликация и предохранение концов хромосом. 0-пункты репликации существуют в хромосомах (сайты инициации репликации) также организмов-эукариотов, состоящих из определенных последовательностей азотистых оснований, причем являются множественными. Эти пункты получили название автономно реплици-рующихся последовательностей (ars-элементов). Определяя количество репликационных вилок, они удалены один от другого на расстоянии 30 000-300 000 пар азотистых оснований. В результате этого по каждой хромосоме двигается много репликационных «вилок», причем одновременно и независимо одна от другой. Инициацию репликации ДНК обеспечивают белки, связанные с 0-пун-ктом репликации, а также белки — киназы. Последние ответственны за выход ДНК из репликации. Но как действуют эти механизмы — это вопрос, который еще не получил разрешения.

Основные  ферменты репликации ДНК

ДНК - полимераза

ДНК-полимераза -- фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна шаблонной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали.

Выделяют ДНК-зависимую  ДНК-полимеразу, использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу, способную также к считыванию информации с РНК (обратная транскрипция).

ДНК-полимеразу считают холоферментом, поскольку  для нормального функционирования она требует присутствия ионов магния в качестве кофактора. В отсутствии ионов магния о ней можно говорить как об апоферментe.

ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с  отрезком цепи нуклеотидов. Среднее  количество нуклеотидов, присоединяемое ферментов ДНК-полимеразой за один акт связывания/диссоциации с матрицей, называют процессивностью.

ДНК - лигазы

Лигаза -- фермент, катализирующий соединение двух молекул  с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой  химической группы от одной из молекул.

Лигазы относятся  к классу ферментов EC 6.

В молекулярной биологии лигазы разделяют на две  большие группы -- РНК-лигазы и ДНК-лигазы. ДНК-лигаза, осуществляющая репарацию  ДНК

ДНК-лигазы -- ферменты, катализирующие ковалентное сшивание цепей ДНК в дуплексе при репликации, репарации и рекомбинации. Они образуют фосфодиэфирные мостики между 5'-фосфорильной и 3'-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молекулами ДНК. Для образования этих мостиков лигазы используют энергию гидролиза пирофосфорильной связи АТФ. Один из самых распространённых коммерчески доступных ферментов -- ДНК-лигаза бактериофага Т4.

ДНК - геликазы

ДНК геликазы - ферменты раскручивающие двуцепочечную  спираль ДНК с затратой энергии гидролиза трифосфатов NTP. Образуемая одноцепочечная ДНК участвует в различных процессах, таких как репликация, рекомбинация, и репарация. ДНК геликазы необходимы для репликации, репарации, рекомбинации и транскрипции. Геликазы присутствуют во всех организмах.

ДНК-топоизомеразы

ДНК-топоизомеразы--ферменты, изменяющие степень сверхспиральности  и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного  разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс  ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II) обеспечивают разделение или образование катенанов - сцепленных кольцевых ДНК (образуются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устранение узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Существует два типа топоизомераз. Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в молекуле фермента выступает то в роли акцептора, то в роли донора фосфорильного конца разрезанной цепи.

Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы  в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепочечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В результате за один акт снимаются два положительных или отрицательных сверхвитка. Топоизомеразы типа II тоже используют тирозиновые остатки для связывания 5-конца каждой разорванной цепи в то время . когда другой дуплекс проходит через место разрыва.

Праймаза

Праймаза--фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза  ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

4. Репликация у прокариотов и эукариотов

Комплементарность азотистых оснований в молекуле ДНК составляет главную сущность молекулярных основ наследственности и позволяет понять, как при  делении клетки синтезируются тождественные молекулы ДНК.

Перед каждым удвоением  хромосом и делением клетки происходит репликация (удвоение) ДНК. Репликацией  называют процесс самокопирование  молекулы ДНК с соблюдением порядка  чередования нуклеотидов, присущего  материнским комплементарным нитям.

Спиралевидная двухцепочная ДНК сначала расплетается (раскручивается) вдоль оси, водородные связи между азотистыми основаниями  рвутся и цепи расходятся. Затем, к  каждой цепи пристраиваются комплементарные  азотистые основания и образуются две новые дочерние молекулы ДНК. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, называют полуконсервативным.

Процесс реплдикации  осуществляется с помощью ферментов, которые получили название ДНК-полимераз. Участок молекулы ДНК, в котором начали расплетаться комплементные нити, называется вилкой репликации. Она образуется у прокариот в определенной генетически детерминированной точке. В молекуле ДНК у эукариот таких точек инициации репликации («стартовых точек») бывает несколько. У эукариот процесс репликации ДНК идет неодинаково. Объясняется это тем, что полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК антипараллельны, т. е. 5'-конец одной цепи соединяется с 3'-концом другой, и наоборот. Материнская цепь, на которой синтез идет от точки старта 5'->3' в виде сплошной линии, называется лидирующей, а вторая цепь, на которой синтез идет от 3'->5' (в противоположном направлении) отдельными фрагментами получила название запаздывающей. Синтез этой цепи сложнее синтеза лидирующей цепи. Он протекает с участием фермента лигазы отдельными фрагментами. Эти фрагменты (участки кодовой нити ДНК) содержат у эукариот 100-200, а у прокариот 1000-2000 нуклеотидов. Они получили название фрагментов Оказаки, по имени открывшего их японского ученого.

Фрагмент ДНК  от одной точки начала репликации до другой точки образует единицу  репликации - репликон. Репликация начинается с определенной точки (локус ori) и  продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплеципрован. Молекулы ДНК прокариотических клеток содержат большое число репликонов, поэтому удваение ДНК начинается в нескольких точках. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.

Репликация  молекул ДНК у прокариот протекает несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК разрывается и один конец ее прикрепляется к клеточной мембране, а на противоположном конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча». Репликация ДНК протекает быстро. Так, у бактерии скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к нитке-матрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов за это время - около 900 нуклеотидов. У эукариот процесс репликации протекает медленно. У них дочерняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту.

ДНК всех живых  существ устроен одинаково. ДНК  разных видов различаются коэффициентом  видоспецифичности, который представляет собой отношение молекулярной суммы  А + Т к молекулярной суме Г + Ц. Видоспецифичность ДНК выражается процентом или долей в ней ГЦ-пар. Коэффициент видовой специфичности разный у разных видов, но в общем наблюдается изменение ГЦ-пар от прокариот к эукариотам, а в пределах последних - от низших к более высокоорганизованным формам.

Углеводно-фосфатный  остов по всей длине во всех молекулах  ДНК имеет однотипную структуру  и не несет генетической информации. Наследственная информация зашифрована  различной последовательностью  оснований. А если последовательность оснований определяет характер белков собаки, коровы, бактерии, вируса и т. д., то соответственная наследственность может передаваться из поколения в поколение.

Таким образом, в структорной организации молекулы ДНК можно выделить первичную  структуру - полинуклеотидную цепь, вторичную структуру - две комплементарные друг другу полинуклеотидные цепи, соединенные водородными связями, и третичную структуру - трехмерную спираль с определенными пространственными характеристиками.

1 Транскрипция у прокариот 
 
ДНК-зависимая РНК-полимераза — это фермент, катализирующий синтез РНК. Он состоит из несколько субъединиц: двух α, одной β, одной β' и одной σ. Их комплекс называется холоферментом (α2ββ'σ) и имеет мол. массу (Мг) около 500 000. Фермент, лишенный σ-субъединицы, называется кор-ферментом. Для инициации транскрипции необходимы холо-фермент, нуклеозидтрифосфат (всегда АТР или GTP) и наличие специального участка в ДНК, называемого промотором. Когда полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК и образуется открытый промоторный комплекс. Промотор - это участок молекулы ДНК, имеющий размер около 40 пар оснований и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. Синтез РНК всегда начинается с оснований А или G в «+»-цепи ДНК. Участок связывания холофермента расположен «левее» сайта инициации (в направлении 3' - 5' в «+»-цепи) на расстоянии примерно 10 оснований. Если сравнить последовательности оснований «+»-цепи ДНК у разных промоторов, то мы обнаружим, что они весьма близки, хотя и не идентичны. Эта так называемая последовательность Прибнова имеет вид TATPuATPu, где Рu означает пурин (А или G). Таким образом, холофермент связывается со специфической последовательностью или группой последовательностей. Обычно на расстоянии около 40 оснований «левее» участка инициации находится второе место связывания РНК-полимеразы, где, как полагают, происходит связывание а-субъединицы с ДНК. 
 
Элонгация цепи РНК — это та стадия транскрипции, которая наступает после присоединения примерно восьми рибонуклеотидов. В этот момент РНК- полимераза претерпевает структурное изменение, при котором от комплекса отделяется σ-субъединица и остается кор-фермент (α2ββ'), катализирующий дальнейшее удлинение цепи РНК. При этом к цепи присоединяются те рибонуклеозидтрифосфаты, которые обеспечивают правильное спаривание с «—»-цепью ДНК. Движущийся вдоль ДНК кор-фермент действует подобно застежке-молнии, «раскрывая» двойную спираль, которая замыкается позади фермента по мере того, как соответствующие основания РНК спариваются с основаниями ДНК в «—»-цепи. «Раскрытая» ферментом область простирается только на несколько пар оснований.  
 
Терминация (прекращение роста) цепи РНК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами. Начало этих участков обычно обогащено GC-парами, а остальная последовательность — АТ-парами. GC-богатый участок часто представляет собой палиндром. Это означает, что при движении вдоль «+»-цепи в одном направлении, а вдоль «—»-цепи - в противоположном читается одна и та же последовательность оснований. В остановке синтеза РНК именно на терминаторе важную роль играет р-белок. 
 
^ Посттранскрипционный процессинг — это процесс созревания, при котором первичный РНК-транскрипт модифицируется и превращается в зрелую РНК. Характер и степень модификации РНК зависят от типа РНК. 
 
Молекулы мРНК у прокариот не подвергаются процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, т. е. происходят одновременно. 5'-конец мРНК может транслироваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до завершения синтеза ее 3'-конца. Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде про-тРНК, которая примерно на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лишние последовательности, расположенные у 5'- и 3'- концов, удаляются с помощью таких ферментов, как рибонуклеазы Q и Р. Иногда молекула про-тРНК состоит из двух или более молекул тРНК, соединенных между собой. Их разделение также осуществляется с помощью рибонуклеаз. Если 3'-конец тРНК не несет концевой последовательности ССА, то эти основания присоединяются при постсинтетической модификации. Все тРНК содержат минорные основания, которые являются химически модифицированными формами четырех главных оснований (А, С, G и U). 
 
Эта модификация происходит после завершения транскрипции. Гены рРНК прокариот расположены в транскрипционных блоках. Три генарРНК Е. coli (16S, 23S и 5S2 ) располагаются вместе с генами нескольких тРНК в одном таком блоке и транскрибируются в виде одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК отделены друг от друга спейсерной РНК. Расщепление первичного транскрипта на отдельные составляющие катализирует рибонуклеаза Q; поскольку этот фермент специфичен к двухцепочечной РНК, предполагают, что в области спейсеров образуются двухцепочечные шпильки, которые фермент узнает и вырезает. 
 
^ 3. Транскрипция у эукариот 
 
У эукариот для транскрипции используются три ДНК - зависимых РНК-полимеразы. Полимераза I локализована в ядрышке, где она катализирует синтез рРНК в виде большого первичного транскрипта, содержащего молекулы рРНК 18S, 5,8S и 28S. Полимераза II находится в нуклеоплазме и, вероятно, участвует в синтезе первичного транскрипта мРНК. Полимераза III также локализована в нуклеоплазме и участвует в синтезе тРНК и 5S-pPHK. 
 
Синтез РНК включает стадии инициации, элонгации и терминации, но в этих процессах часто принимают участие другие ферменты и последовательности оснований, чем у прокариот. Например, промоторные последовательности у эукариот отличаются от таковых у прокариот. Однако первыми основаниями, включаемыми в РНК при инициации, являются, как и у прокариот, А или G. 
 
Молекулы мРНК обычно образуются из больших по размеру молекул-предшественников, называемых гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Для образования зрелой мРНК эти молекулы подвергаются модификации по 5'- и З'-концами и сплайсингу. После такой модификации транскрипты переносятся из ядра в цитоплазму. 
 
Сплайсинг гяРНК — это удаление последовательностей РНК, соответствующих интронам ДНК, и соединение участков, которые транскрибированы с кодирующих последовательностей (экзонов). Место сплайсинга должно быть определено с высокой точностью, поскольку ошибка даже в одно основание приведет к синтезу белка с неправильной аминокислотной последовательностью. Такая специфичность сплайсинга обеспечивается строго определенной последовательностью оснований в интроне, отвечающей обычно основаниям GU или GA в начале соответствующей РНК и основаниям AG - в конце. 
 
Модификация 5'-конца мРНК приводит к образованию особой последовательности, называемой кэп-структурой. При модификации 3'-конца к нему присоединяется последовательность poly(A) длиной 150-200 нуклеотидов. 
 
Процессинг тРНК у эукариот протекает по такому же механизму, как и у прокариот. Функционально активные молекулы образуются из более длинного предшественника, который подвергается расщеплению и модификации с включением минорных оснований. 
 
Процессинг рРНК также аналогичен соответствующему процессу у прокариот. Первичный транскрипт содержит участки, отвечающие 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК, разделенные спейсерами. Как и у прокариот, эти три рРНК образуются при расщеплении спейсерных последовательностей. 

13

Репарация ДНК

восстановление  дефектов в ДНК, возникших в результате мутации или рекомбинации. Осуществляется системой репаративных ферментов, одни из к-рых устанавливают место  повреждения, др. его «вырезают», третьи синтезируют поврежденные участки, четвертые встраивают их в молекулу ДНК. Большая часть повреждений ДНК у бактерий устраняется в результате Р. Вирусы не имеют собственной системы Р. Р. генома у них осуществляется механизмами реактивации (см. Реактивация).

 

 

14

Генети́ческий код - это свойственный всем живым организмам способ кодирования аминокислотной последовательности белков при помощи последовательности нуклеотидов.

Свойства генетического кода

1. Триплетность — значащей единицей кода является сочетание трёх нуклеотидов (триплет, или кодон).
2. Непрерывность — между триплетами нет знаков препинания, то есть информация считывается непрерывно.
3. Неперекрываемость — один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух или более триплетов. (Не соблюдается для некоторых перекрывающихся генов вирусов, митохондрий и бактерий, которые кодируют несколько белков, считывающихся со сдвигом рамки).
4. Однозначность — определённый кодон соответствует только одной аминокислоте. (Свойство не является универсальным. Кодон UGA у Euplotes crassusкодирует две аминокислоты - цистеин и селеноцистеин)
5. Вырожденность (избыточность) — одной и той же аминокислоте может соответствовать несколько кодонов.
6. Универсальность — генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности — от вирусов до человека (на этом основаны методы генной инженерии)

Митохондриальный и хлоропластный коды

Помимо  генетического кода, который содержится в ядерной ДНК, существует генетический код, содержащийся в ДНК митохондрий  животных и человека, а также в  ДНК хлоропластов растений. В митохондриях и хлоропластах помимо ДНК существуют и другие структуры, которые в совокупности с ДНК образуют самостоятельный аппарат синтеза белков. Размеры митохондриальных рибосом очень варьируют. В частности, размеры митохондриальных рибосом человека составляют 60 S.

Для митохондриального  генетического кода характерны те же структуры и свойства и те же механизмы транскрипции и трансляции, что и в случае ядерного генетического кода. Однако известны и отличия. В митохондриальной ДНК все нуклеотиды входят в состав кодонов, кодирующих либо белки, либо рРНК и тРНК. Для трансляции используется только 22 тРНК (в отличие от 31 тРНК в ядерном коде и 30 тРНК в хлоропластном коде), причем отдельные молекулы тРНК могут узнавать любое основание, находящееся в кодоне в третьем положении. Митохондриальная ДНК человека и других млекопитающих содержит 64 кодона, из которых 4 являются стоп-кодонами.