Доказательства роли ДНК в наследственности

Элементы, которые  сходны по транспозиции с транспозоном, транспозируются прямо через копии ДНК, характеризуются инвертированными терминальными повторами и открытыми рамками чтения, кодирующими фермент Транспозоны. К таким элементам принадлежат транспозоны Р и hobo у дрозофил, Ас, ДЗ и Мм — у растений кукурузы, Тс/1 — у нематод, TU — у морских ежей.

В геноме человека найдена последовательность Alu длиной порядка 300 пар оснований и повторяющаяся  в 100 000-300 000 копиях на гаплоидный набор  хромосом, что составляет около 5% генома человека. Alu-последовательности сходны с прямыми копиями ДНК на молекулах мРНК, ибо они содержат «отрезок» по-лидезоксиаденозина на их 3'-концах, а сходство Alu-последователь-ностей с транспозонами определяется тем, что они фланкированы прямыми повторами 7-20 пар оснований.

В геноме человека открыты тандемно расположенные  повторяющиеся последовательности Hinf, составленные из субъединиц длиной 172 и 147 пар оснований, а также транспозоны .Mariner, тоже представленные повторами  оснований. Транспозоны Mariner обнаружены, кроме того, в геномах дрозофилы, отдельных членистоногих, нематод и планарий.

8

В отличие  от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном  клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значительно  меньшая часть - в митохондриях, хлоропластах и других пластидах. Так же, как и у прокариот, информационной макромолекулой генома эукариот является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. ДНК-белковые комплексы эукариот получили название хроматина . На протяжении клеточного цикла хроматин претерпевает высокоупорядоченные структурные преобразования в виде последовательных конденсаций-деконденсаций. В соматических клетках при максимальной конденсации вметафазе митоза эти преобразования сопровождаются формированием метафазных хромосом . Морфология и число метафазных хромосом являются уникальными характеристиками вида.

Совокупность  внешних признаков хромосомного набора эукариот получила название кариотипа . Эти признаки используются в систематике.

Содержание  ДНК у эукариот в расчете на одну клетку в среднем на два-три  порядка выше, чем у прокариот, и у разных видов животных изменяется от 168 пг (амфибии) до 1 пг (некоторые  виды рыб). У человека имеется около 6 пг ДНК на диплоидный геном, суммарная длина которой приближается к 6*109 п.о. ( табл. I.1 ). Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить одним лишь увеличением потребности этих организмов в дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими последовательностями нуклеотидов. Размер генома организмов, находящихся на более низких ступенях эволюционного развития, зачастую превышает размеры геномов более высокоорганизованных животных и растений. Известно, что большая часть ДНК генома эукариот не кодирует РНК и белки, и ее генетические функции не вполне понятны.

Дезоксирибонуклеиновая  кислота (ДНК) — один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков. 
 
С химической точки зрения, ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков, нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы. В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована. В целом структура молекулы ДНК получила название «двойной спирали». 
 
В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин — только с цитозином.  

ДНК является носителем  генетической информации, записанной в виде последовательности нуклеотидов  с помощью генетического кода. С молекулами ДНК связаны два основополагающих свойства живых организмов — наследственность и изменчивость. В ходе процесса, называемого репликацией ДНК, образуются две копии исходной цепочки, наследуемые дочерними клетками при делении, таким образом образовавшиеся клетки оказываются генетически идентичны исходной.

 
Генетическая информация реализуется  при экспрессии генов в процессах  транскрипции (синтеза молекул РНК  на матрице ДНК) и трансляции (синтеза  белков на матрице РНК). 
 
Последовательность нуклеотидов «кодирует» информацию о различных типах РНК: информационных, или матричных (иРНК), рибосомальных (рРНК) и транспортных (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на основе ДНК в процессе транскрипции. Роль их в биосинтезе белков (процессе трансляции) различна. Информационная РНК содержит информацию о последовательности аминокислот в белке, рибосомальные РНК служат основой для рибосом (сложных нуклеопротеиновых комплексов, основная функция которых — сборка белка из отдельных аминокислот на основе иРНК), транспортные РНК  доставляют аминокислоты к месту сборки белков — в активный центр рибосомы, «ползущей» по иРНК.

 
Генетическая информация, закодированная в ДНК, должна быть прочитана и  в конечном итоге выражена в синтезе  различных биополимеров, из которых  состоят клетки. Последовательность оснований в цепочке ДНК напрямую определяет последовательность оснований в РНК, на которую она «переписывается» в процессе, называемом транскрипцией. В случае мРНК эта последовательность определяет аминокислоты белка. Соотношение между нуклеотидной последовательностью мРНК и аминокислотной последовательностью определяется правилами трансляции, которые называются генетическим кодом. Генетический код состоит из трёхбуквенных «слов», называемых кодонами, состоящих из трёх нуклеотидов (то есть ACT CAG TTT и т. п.). Во время транскрипции нуклеотиды гена копируются на синтезируемую РНК РНК-полимеразой. Эта копия в случае мРНК декодируется рибосомой, которая «читает» последовательность мРНК, осуществляя спаривание матричной РНК с транспортными РНК, которые присоединены к аминокислотам. Поскольку в трёхбуквенных комбинациях используются 4 основания, всего возможны 64 кодона (4³ комбинации). Кодоны кодируют 20 стандартных аминокислот, каждой из которых соответствует в большинстве случаев более одного кодона. Один из трёх кодонов, которые располагаются в конце мРНК, не означает аминокислоту и определяет конец белка, это «стоп» или «нонсенс» кодоны — TAA, TGA, TAG. 

Деление клеток необходимо для размножения одноклеточного и роста многоклеточного организма, но до деления клетка должна удвоить геном, чтобы дочерние клетки содержали ту же генетическую информацию, что и исходная клетка. Из нескольких теоретически возможных механизмов удвоения (репликации) ДНК реализуется полуконсервативный. Две цепочки разделяются, а затем каждая недостающая комплементарная последовательность ДНК воспроизводится ферментом ДНК-полимеразой. Этот фермент строит полинуклеотидную цепь, находя правильное основание через комплементарное спаривание оснований и присоединяя его к растущей цепочке. ДНК-полимераза не может начинать новую цепь, а только лишь наращивать уже существующую, поэтому она нуждается в короткой цепочке нуклеотидов (праймере), синтезируемом праймазой. Так как ДНК-полимеразы могут строить цепочку только в направлении 5' --> 3', для копирования антипараллельных цепей используются разные механизмы.

«Эгоистичная» ДНК, избыточная ДНК, «хлам» (selfish DNA, junk DNA) [франц. egoisme — эгоизм, от лат. ego — я] — большая часть эукариотического генома с неизвестными функциями (или не выполняющая определенных функций), лишенная активных генов, которая предположительно реплицирует только себя и использует клетку хозяина и ее синтезирующие способности лишь для этих целей. «Э.»ДНК включает сателлитную ДНК, спейсерную ДНК и др. типы умеренно и высокоповторяющихся, а также большую часть уникальных нуклеотидных последовательностей. Различия в размерах геномов у различных таксономических групп обусловлены в значительной мере содержанием «Э.»ДНК, однако единой концепции о ее возникновении и роли в эволюционных процессах пока нет. «Э.»ДНК не обнаружена у бактерий и вирусов. Концепция «Э.»ДНК предложена в 1980 г. Ф. Криком. Син.: некодирующая ДНК.

Как уже упоминалось, двойную спираль ДНК можно  расплавить (денатурировать), нагревая раствор ДНК до температуры 100°С. При этом комплементарные цепи вследствие разрыва водородных связей расходятся. При постепенном охлаждении раствора комплементарные цепи могут вновь ассоциировать, восстанавливая структуру двойной спирали.

Этот подход используют для выяснения присутствия в ДНК повторяющихся нуклеотидных последовательностей. Если таковые имеются, то некоторая фракция ДНК будет ренатурировать быстрее, поскольку соответствующим одноцепочечным участкам легче найти партнера. Участки ДНК, представленные уникальными последовательностями, ренатурируют медленнее.

ДНК бактерий почти не содержит повторов, в то время как в ДНК эукариот повторы многочисленны. Так, около 70% ДНК мыши представлены уникальными последовательностями, около 10% содержат очень часто повторяющиеся (до 106 раз) участки. Остальные 20% ДНК — это нуклеотидные последовательности, повторяющиеся умеренно — от 102 до 105 раз на геном (табл. 6.3).

Таблица 6.3. Уникальные и повторяющиеся  последовательности (доля) в геноме некоторых эукариот (по F. Ayala, J. Kiger, 1980)

Примечание. * 20—50 копий, ** 250—6000 копий, *** до 10'1 копий.

Принято считать, что подавляющее  большинство функционирующих генов является уникальными последовательностями. Из этого правила есть исключения. Это, в частности, гены, кодирующие структуру гистонов и рРНК, которые располагаются в виде тандемных повторов. Большинство умеренно повторяющихся последовательностей не функционирует в качестве матриц, т. е. не транскрибируется. У дрозофилы и мыши повторяющиеся последо

вательности очень часто представлены короткими участками — около 10 п. н. Большая часть повторов, по-видимому, играет структурную или регуляторную роль. Они локализованы преимущественно в прицентромерном гетерохроматине.

9

Хроматин, его классификация. Строение хромосом.  
В ядре клеток обнаруживаются мелкие зернышки и глыбки материала, который окрашивается основными красителями и поэтому был назван хроматином (от греч. chroma – краска).  
Хроматин представляет собой дезоксирибонуклеопротеид (ДНП) и состоит из ДНК, соединённой с белка-ми-гистонами или негистоновыми белками. Гистоны и ДНК объединены в структуры, которые называются нук-леосомами. Хроматин соответствует хромосомам, которые в интерфазном ядре представлены длинными перекру-ченными нитями и неразличимы как индивидуальные структуры. Выраженность спирализации каждой из хромо-сом неодинакова по их длине. Реализацию генетической информации осуществляют деспирализованные участки хромосом.  
Классификация хроматина. Различают два вида хроматина:  
1) эухроматин, локализующийся ближе к центру ядра, более светлый, более деспирилизованный, менее компакт-ный, более активен в функциональном отношении. Предполагается, что в нем сосредоточена та ДНК, которая в интерфазе генетически активна. Эухроматин соответствует сегментам хромосом, которые деспирализованы и от-крыты для транскрипции. Эти сегменты не окрашиваются и не видны в световой микроскоп.  
2) гетерохроматин - плотно спирализованная часть хроматина. Гетерохроматин соответствует конденсированным, плотно скрученным сегментам хромосом (что делает их недоступными для транскрипции). Он интенсивно окра-шивается основными красителями, и в световом микроскопе имеет вид тёмных пятен, гранул. Гетерохроматин располагается ближе к оболочке ядра, более компактен, чем эухроматин и содержит “молчащие” гены, т.е. гены, которые в настоящий момент неактивны. Различают конститутивный и факультативный гетерохроматин. Консти-тутивный гетерохроматин никогда не переходит в эухроматин и является гетерохроматином во всех типах клеток. Факультативный гетерохроматин может превращаться в эухоматин в некоторых клетках или на разных стадиях онтогенеза организма. Примером скопления факультативного гетерохроматина является тельце Барра – инактиви-рованная Х-хромосома у самок млекопитающих, которая в интерфазе плотно скручена и неактивна. В большинст-ве клеток оно лежит у кариолеммы.  
Таким образом, по морфологическим признакам ядра (по соотношению содержания эу- и гетерохромати-на) можно оценить активность процессов транскрипции, а, следовательно, синтетической функции клетки. При её повышении это соотношение изменяется в пользу эухроматина, при снижении – нарастает содержание гетеро-хроматина. При полном подавлении функций ядра (например, в поврежденных и гибнущих клетках, при орогове-нии эпителиальных клеток эпидермиса – кератиноцитов, при образовании ретикулоцитов крови) оно уменьшается в размерах, содержит только гетерохроматин и окрашивается основными красителями интенсивно и равномерно. Такое явление называется кариопикнозом (от греч. karyon – ядро и pyknosis – уплотнение).  
Хроматин и хромосомы представляют собой дезоксирибонуклеопротеиды (ДНП), но хроматин – это рас-крученное, а хромосомы – скрученное состояние. Хромосом в интерфазном ядре нет, они хромосомы появляются при разрушении ядерной оболочки (во время деления).  
Распределение гетерохроматина (топография его частиц в ядре) и соотношение содержания эу- и гетеро-хроматина характерны для клеток каждого типа, что позволяет осуществить их идентификацию как визуально, так и с помощью автоматических анализаторов изображения. Вместе с тем, имеются определенные общие закономер-ности распределения гетерохроматина в ядре: его скопления располагаются под кариолеммой, прерываясь в об-ласти пор (что обусловлено его связью с ламиной) и вокруг ядрышка (перинуклеолярный гетерохроматин), более мелкие глыбки разбросаны по всему ядру.  
Строение хромосом  
Хромосомы представляют собой наиболее упакованное состояние хроматина. Наиболее компактные хромо-сомы видны на стадии метафазы, при этом они состоят из двух хроматид, связанных в области центромеры. 

Эухроматин, активный хроматин — участки хроматина, сохраняющие  деспирализованное состояние элементарных дезоксирибонуклеопротеидных нитей (ДНП) в покоящемся ядре, т. е. в интерфазе (в отличие от других участков, сохраняющих спирализованное состояние — гетерохроматина) .  
Эухроматин отличается от гетерохроматина также способностью к интенсивному синтезу рибонуклеиновой кислоты (РНК) и большим содержанием негистоновых белков. В нём, помимо ДНП, имеются рибонуклеопротеидные частицы (РНП-гранулы) диаметром 200—500, которые служат для завершения созревания РНК и переноса ее в цитоплазму. Эухроматин содержит большинство структурных генов организма.  
 
Гетерохроматин — участки хроматина, находящиеся в течение клеточного цикла в конденсированном (компактном) состоянии. Особенностью гетерохроматиновой ДНК является крайне низкая транскрибируемость.

10

 
 
Длительное время считали, что  ДНК содержится только в ядрах  клеток, и вся наследственность понималась в качестве ядерной. Между тем с развитием молекулярно-генетических методов исследований стали обнаруживать ДНК, находящуюся за пределами ядра как у прокариотов, так и в клетках эукариотов. Эта ДНК получила название экстраядерной (экстрахромосомной) ДНК, а контролируемую такой ДНК последовательность — экстраядерной или экстрахромосомной. 
 
Перечислим формы экстраядерных (экстрахромосомных) ДНК прокариотов и эукариотов: 
 
1. ДНК плазмид: бактерии, низшие грибы и другие организмы. 
 
2. ДНК органелл: митохондрии, хлоропласты, кинетопласты. 
 
3. ДНК амплифицированных генов: гены, контролирующие синтез отдельных белков. 
 
4. Малые полидисперсные кольцевые и линейные ДНК: экстрахромосомные копии повторяющихся (часто транспозируемых) последовательностей ДНК. 
 
Плазмиды. Плазмиды встречаются в цитоплазме как прокариотов, так и эукариотов, причем у бактерий они являются обычными обитателями. В частности, они идентифицированы почти у всех видов бактерий, имеющих медицинское (являющихся возбудителями болезней) или сельскохозяйственное и промышленное значение. 
 
Плазмиды бактерий — это генетические структуры, находящиеся в цитоплазме и представляющие собой молекулы ДНК размером от 2250 до 400 000 пар азотистых оснований. Они существуют обособленно от хромосом в количестве от одной до нескольких десятков копий на одну бактериальную клетку. Различают три типа бактериальных плазмид: факторы генетического переноса, коин-тегративные и неконъюгативные плазмиды (рис. 108). 
 
Факторы переноса обладают лишь генами репликации и переноса. Благодаря генам репликации такие плазмиды способны к бесконечно долгому поддержанию и воспроизводству в автономном (экстрахромосомном) состоянии, а благодаря генам переноса — к передаче о т одних клеток к другим, часто преодолевая в скрещиваниях видовые и родовые барьеры. Бактерии, содержащие плазмиды этого типа, служат генетическими донорами. Они способны вступать в скрещивания с клетками, не содержащими плазмиды. 
 
Коинтегративные плазмиды представляют собой фактор генетического переноса, сцепленный с генами, контролирующими синтез тех или иных белков, имеющих значение для бактерий. Например, плазмиды R контролируют синтез ферментов, придающих бактериям устойчивость к антибиотикам, сульфани-ламидам и другим лекарственным веществам, плазмиды Ent — синтез энтеротоксинов, Col — колицинов, Hly — гемолизинов. Известны также плазмиды, контролирующие разрушение многих органических соединений и др. свойства. Благодаря фактору переноса эти плазмиды конъюгативны. 
 
Неконъюгативные плазмиды — это плазмиды, которые не передаются от одних клеток к другим, т. к. они не обладают фактором переноса. Они тоже детерминируют лекарственную устойчивость и другие свойства бактерий. Передача неконъюгативных плазмид от одних бактерий к другим обеспечивается содержащимися в клетках факторами переноса или коинтегративными плазмидами, которые мобилизуют их на перенос. Среди эукариотов плазмиды идентифицированы у низших грибов. Одна из таких плазмид у дрожжей S. cerevisiae представляет собой кольцевые молекулы ДНК размером в 6318 пар оснований, существующие в количестве 80 копий на гаплоидный геном и кодирующие белки, необходимые для собственной репликации и рекомбинации. У нейроспоры (Neurospora) плазмиды обнаружены в виде малых кольцевых молекул ДНК размером 4200-5200 пар оснований, встречающихся в количестве около 100 копий на гаплоидный геном, а у плесени Aspergilus niger — в виде кольцевых молекул ДНК размером около 13 500 пар оснований в количестве около 100 копий на клетку. 
 
^ ДНК органелл. ДНК этого класса обнаружена в случае как низших, так и высших эукариотов. 
 
Молекулы ДНК, выделяемые из митохондрий соматических клеток животных и хлоропластов клеток растений, характеризуются небольшими размерами. Например, размеры молекул ДНК (гено-мов) митохондрий (мтДНК) разных животных (включая плоских червей, насекомых и млекопитающих), составляют 15 700—20 000, человека — 16 569 пар азотистых оснований. У простейших, например у трипаносом и парамеций, митохондриальный геном равен 22 000 и 40 000 пар оснований. Геном хлоропластов у высших растений составляет 12 000 — 200 000 пар оснований, у дрожжей — 78 000 пар оснований, у зеленых водорослей — 180 000 азотистых оснований. Во многих случаях показано, что ДНК митохондрий и хлоропластов сплошь состоит из нуклеотидных последовательностей, гомологичных последовательностям хромосомной ДНК. 
 
Митохондриальный геном человека состоит из 13 генов, нукле-отидная последовательность которых определена и для которой характерно полное или почти полное отсутствие некодирующих участков. Эти гены кодируют собственные рибосомные РНК (12S- и 168-рРНК.) и 22 разные транспортные РНК, а также разные поли-пептиды, включая субъединичные компоненты I, II, III оксидазы цитохрома С, субъединицы 6 АТФазы, цитохрома В и девяти других белков, функции которых не известны. 
 
Геном хлоропластов ряда высших растений состоит из 120 генов. Они кодируют 4 рибосомных РНК, 30 рибосомных белков, часть субъединиц хлоропластной РНК-полимеразы, часть белков, содержащихся в фотосистемах I и II, белковые субъединицы АТФ-синтетазы и отдельных ферментов цепи транспорта электронов, а также белковую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксидазы и очень многих тРНК. Хлоропластный геном очень сходен с бактериальным геномом как по организации, так и по функциям. В митохондриальном геноме человека, вероятно, отсутствуют интроны, но в ДНК хлоропластов некоторых высших растений, а также в ДНК митохондрий грибов интроны обнаружены. Считают, что хлоропластные геномы высших растений остаются без изменений примерно несколько миллионов лет. Возможно, что такая древность характерна и для митохондриальных геномов млекопитающих, включая человека. 
 
Характер передачи мтДНК по наследству у разных организмов различен. Например, у дрожжей в результате одинакового вклада мтДНК сливающимися гаплоидными клетками в зиготу митохондриальный геном наследуется потомством от обоих родителей. Между тем показано, что у D. melanogaster и мышей мтДНК передается по материнской линии. По данным посемейного распределения ДНК в больших семьях предполагают, что мтДНК у человека также наследуется по материнской линии. Однако у морских голубых двустворчатых раковин из рода Mytilus она передается как по материнской, так и по мужской линии, причем тип передачи зависит от пола потомства. Женские митохондрий передаются матерями сыновьям и дочерям, тогда как мужские митохондрий передаются отцами сыновьям. Но у этих животных иногда встречается и передача женских митохондрий от отцов к дочерям. У большинства высших растений ДНК хлоропластов тоже наследуется по материнской линии. 
 
ДНК, обнаруживаемая в кинетопластах трипаносом, представлена малыми (2,500 п. о.) и крупными (3700 п. о.) кольцевыми молекулами. 
 
^ ДНК амплифицированных генов. Эта ДНК встречается в форме экстрахромосомных кольцевых молекул. Например, когда эука-риотические клетки культивируют в средах с лекарственными веществами, то происходит селекция резистентных клеток с повышенным количеством копий гена, контролирующего резистен-тность. Клетки многих опухолей содержат также экстрахромосомные амплифицированные гены (наряду с хромосомными). 
 
^ Малые полидисперсные кольцевые и линейные ДНК. Молекулы ДНК этого типа (мпкДНК) имеют размеры от нескольких сот до десятков тысяч нуклеотидных пар и встречаются как в цитозоле, так и в ядре и митохондриях клеток многих организмов-эукариотов. Эти молекулы ДНК происходят или связаны с ДНК хромосом и органелл. Многие из этих молекул ДНК способны к транспозиции (см. § 45).