Частота и значение использования специальных методов окрашивания гистологических препаратов для выявления helicobacter pylori

4. Хронический гастрит и инфекция Helicobacter pylori

Частота ХГ, ассоциированного с НР – инфекцией, составляет 65-80%, однако ведущая роль НР в этом процессе вызывает сомнения. Нельзя забывать, что  существуют формы ХГ, безусловно, не связанные с инфекционным фактором: это аутоиммунный ХГ (типа А), токсико-химический ХГ (типа С) и часть особых форм ХГ (радиационный, гранулематозный, эозинофильный).

При изучении микробиоценоза желудка у больных с острым и активным ХГ мы установили, что  в 82,1 ± 7,2% случаев СОЖ антрального  отдела желудка обнаруживают, помимо НР, 55 видов условно-патогенных бактерий, среди которых преобладают стрептококки (30,9 ± 6,2%), стафилококки (16,4 ± 5%), энтеробактерии (10,9 ± 4,2%), грибы рода Candida (10,9 ± 3.9%) и коринебактерии (7,3 ± 3,5%). НР были выявлены при остром гастрите в 7,1 ± 4,8 % случаев, при антральном ХГ в 18 ± 4,9%, причем всегда в комплексе с другими бактериями.

При изучении вирулентных (ядовитых) свойств выделенной из СОЖ бактериальной  флоры в 27,3 ± 6,0% случаев была выявлена уреазная активность, в 36,3 ± 6,5% - природные  или приобретенные в процессе адаптации к агрессивной желудочной среде патогенные свойства, в 45,5% ± 6,7% - резистентность к различным АБП (антибактериальным препаратам). В целом признаки патогенности установлены у 56,3 ± 6,7% бактерий, выделенных из СОЖ антрального отдела. Вся выявленная микрофлора обладала адгезивностью, а большинство бактерий – инвазивностью (в отличие от НР) и патогенными свойствами.

Результаты проведенных  исследований дают всякие основания  сделать предположения об участии  выявленной М – микрофлоры в развитии инфекционно – воспалительного  процесса в СОЖ наряду с НР –  инфекцией, а возможно и без ее участия.

Этиология. Хронический гастрит развивается при действии на слизистую оболочку желудка прежде всего экзогенных факторов: нарушение режима питания и ритма питания, злоупотребление алкоголем, действие химических, термических и механических агентов, влияние профессиональных вредностей и т. д. Велика роль и эндогенных факторов – аутоинфекции (Campylobacter pyloridis), хронической аутоинтоксикации, нейроэндокринных нарушений, хронической сердечно-сосудистой недостаточности, аллергических реакций, регургитации дуоденального содержимого в желудок (рефлюкс). Важным условием развития хронического гастрита является длительное воздействие патогенных факторов экзогенной или эндогенной природы, способное "сломать" привычные регенераторные механизмы постоянного обновления эпителия слизистой оболочки желудка. Нередко удается доказать длительное влияние не одного, а нескольких патогенных факторов

5. Методы диагностики для выявления Helicobacter pylori

Обязательными тестами  для определения Helicobacter pylori  являются гистологический и уреазный.

Цитологическое исследование

Для цитологического исследования используются мазки-отпечатки (1-2 и  более), полученные при эндоскопии из биоптатов слизистой оболочки (СО) антрального отдела желудка. Биоптат  берется прицельно из участков с  наиболее выраженными визуальными  отклонениями от нормы (гиперемия, отек), но не из дна язв и эрозий. Высушенные мазки окрашиваются.

Применяемые паноптические методы окраски позволяют выявить морфологические  особенности строения ядер и цитоплазмы клеток слизистой оболочки, наличие Helicobacter pylori, ориентировочно оценить  количество микроорганизмов. Как правило, НР располагаются в слизи, имеют  спиралевидную, изогнутую форму, могут быть S-образными. иметь вид «крыльев летящей чайки».

При изучении в цитологических препаратах можно выделить три степени обсеменённости слизистой оболочки: слабая {+) —  до 20. средняя (++) — до 40, высокая (+++) — более 40 микробных тел в поле зрения при увеличении х360.

При обнаружении в мазках-отпечатках Helicobacter pylori    выявляется также и клеточная инфильтрация, характеризующаяся наличием лимфоцитов, плазматических клеток, нейтрофилией и эозинофилией.

По преобладанию тех или  иных клеточных элементов можно  косвенно судить об активности и выраженности воспаления, кроме того, цитологическое исследование позволяет выявить  в клетках слизистой оболочки наличие пролиферативных процессов  и слепень их выраженности, метаплазии (кишечной в желудке и желудочной в дуоденуме), дисплазии и её степени  тяжести, злокачественного новообразования. Однако цитологический метод не дает информации о структуре исследуемой  слизистой оболочки.

Уреазный  тест

По скорости выявления персистирующей Helicobacter pylori в слизистой оболочке цитологическому не уступает уреазный экспресс-метод, основанный на уреазной активности Helicobacter pylori. Teст состоит  из геля-носителя, содержащего мочевину, бактериостатический агент и  фенол-рол в качестве индикатора рН. Индикатор меняет цвет от желтого  к малиновому, когда под действием  уреазы происходит гидролиз мочевины с образованием аммиака, сдвигающего  рН среды в щелочную сторону. Биоптат  слизистой оболочки, полученный при  эндоскопии, помещают в тест, Малиновое  окрашивание теста, наступившее  вслед за этим, свидетельствует о  наличии в биоптате Helicobacter pylori. Изменение цвета среды происходит только в том случае, если в биоптате присутствует уреаза, выделенная Helicobacter pylori. Время изменения окраски теста косвенно свидетельствует о количестве жизнеспособных бактерий. Появление малинового окрашивания в течение первого часа соответствует значительной инфицированности слизистой оболочки Helicobacter pylori (+++), в течение последующих двух часов— умеренной (++), к концу суток - незначительной (+). Если же окрашивание наступает в более поздние сроки — результат считается отрицательным

Ложноотрицательные результаты имеют  место у больных при слабой обсемененности слизистой оболочки. Ложные результаты исключаются при  правильной обработке эндоскопов и  биопсийных щипцов, Для повышения  достоверности диагностики геликобактериоза рекомендуется сочетание обоих, гистологического и уреазного, методов, особенно важно их проведение не ранее  чем через четыре недели после  окончания антибактериального лечения, так как наличие персистирующей инфекции является основанием к проведению повторного курса комбинированной  антигеликобактерной терапии.

Существует немало модификаций  уреазного теста, и любой из них  может оказаться полезным для  диагностики геликобактериоза (например, ускоренный де-нол-тест фирмы «Яманучи Юроп», CLO-тест, Австралия, и др.).

13С уреазный дыхательный тест

Метод неинвазивен, абсолютно безопасен, позволяет определять степень колонизации  слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori и является оптимальным для  контроля эрадикационной терапии. Исследование проводится натощак, Вначале в пластиковые  пробирки с интервалами в 1 мин берутся две фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Затем принимается внутрь легкий пробный завтрак (молоко, сок и др.) и тестовый субстрат (водный раствор мочевины, меченной 13С). В последующем в течение часа через 15 мин берутся четыре пробы выдыхаемого воздуха.

Содержание стабилизированного изотопа  в выдыхаемом воздухе определяется с помощью масс-спектрометра, В  соответствии с этим рассматриваются 4 степени инфицированности Helicobacter pylori: легкая — менее 3.5%, средняя — 3,5-6,4%, тяжелая — 6,5-9.4%, крайне тяжелая  — более 9,5%. В норме содержание стабилизированного изотопа 13С не превышает 1% общего количества С02 в выдыхаемом воздухе.

Дополнительные  методы диагностики Helicobacter pylori

Микробиологические методы

Материалом исследования для микробиологической диагностики Helicobacter pylori являются биоптаты из слизистой оболочки желудка или  двенадцатиперстной кишки, полученной в условиях максимальной стерильности. Инкубация посевов осуществляется я в микроаэрофильных условиях при  содержании кислорода не более 5%. Такие  условия создаются путем заполнения герметически закрывающихся сосудов  газовой смесью (5% кислорода, 10% углекислого  газа, 85% азота), при использовании  специальных газогенераторных химических пакетов. На кровяной питательной среде  геликобактер на 3-5 сут. формирует мелкие круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1—3 мм.

В дальнейшем проводится идентификация  выделенных культур, определяются их морфологические, тинкториальные свойства, чувствительность к антибиотикам, подвижность и  приводятся другие специальные исследования в зависимости от возможностей и  задач, стоящих перед исследователем. Воспользоваться этим методом в условиях обычной лаборатории довольно трудно.

Гистологические методы

Гистологические методы получили широкое  распространение, так как позволяют  быстро обнаружить Helicobacter pylori в биоптатах  и одновременно изумить морфологические  изменения в слизистой оболочке. Наиболее простым и доступным  метолом выявления Helicobacter pylori является окраска по Романовскому – Гимзе  без дифференцировки. Helicobacter pylori при  этом окрашиваются в темно-синий  цвет, они хорошо видны как на поверхности эпителия, так и в  глубине ямок. Для оценки состояния  слизистой оболочки и обнаружения Helicobacter pylori достаточно двух биоптатов.

Материалом может служить любой  участок слизистой оболочки желудка  и двенадцатиперстной кишки, но при  этом обязательно следует исследовать  прицельно взятые биоптаты из антрального  отдела в 2—3 см от привратника из участка  визуально более выраженного  воспаления (гиперемия, отёк), но не из дна эрозии и язвы. Частота выявления Helicobacter pylori с помощью гистологического метода хорошо корригирует с другими  методами и составляет не менее 75-80%, Результативность метода зависит от многих факторов, в том числе и  от способа приготовления и окраски  препарата, В последнее время  разработаны новые методы, среди  которых наиболее чувствителен им муноцитохимический с применением моноклональных антител  и комплекса авидин-биотин-пироксидазы.

Весьма обнадеживающие результаты получены при выявлении Helicobacter pylori методом гибридизации ДНК в обычных  парафиновых срезах. Методика не только чувствительна, но и высокоспецифична, с ее помощью можно идентифицировать различные штаммы геликобактера  и понять природу повторного обнаружения Helicobacter pylori после успешного лечения (новая ли это инфекция или размножение сохранившихся бактерий).

Иммунологические методы

У всех больных, инфицированных Helicobacter pylori, в слизистой оболочке желудка  и соответственно в двенадцатиперстной кишке образуются антитела. Специфический  гуморальный иммунный ответ против антигенов геликобактера отчетливо  регистрируется через 3—4 недели после  инфицирования. Антитела могут быть определены различными методами (в  реакции преципитации и др.), но наибольшее значение имеет метод иммуноферментного  анализа (ИФА). Этим тестом выявляются антитела IgG, IgA, IgM классов в сыворотке  крови, а также секреторные IgA. IgM в слюне и содержимом желудка. В практике используют ИФА по определению IgG и реже IgA-антител в сыворотке  крови.

Этот метод в основном используется с целью выявления инфицированности больных с гастродуоденальной патологией и контроля эффективности антибактериального лечения в отдаленные сроки наблюдения. Преимущество метода состоит в том, что он выявляет факт инфицирования  не только при манифестных, но и при  субклинических формах, а также в  стадии ремиссии заболевания. Следует  также иметь в виду, что тест остается положительным еще не менее  месяца после успешной ликвидации Helicobacter pylori, а на ранней стадии, в течение 2—3 недель с момента инфицирования, тест оказывается отрицательным.

В настоящее время в практику внедряются более совершенные методы определения Helicobacter pylori: полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение антигена в кале и др.

6. Практическая часть

За все время прохождения  производственной практики, мною было проведено исследование, а именно учет результатов диагностики Helicobacter pylori. За период с февраля 2010 года по май 2013 года было обследовано 114 человек.

Таблица