Noţiuni generale

Lucrarea de laborator nr.4

1. Noţiuni generale

Rolul substanţelor fenolice în formarea calităţii vinurilor roşii

Importanţa compuşilor fenolici pentru calitatea vinurilor este bine cunoscută. Aceşti compuşi contribuie la definirea caracterelor organoleptice, a valorii igienico-alimentare şi mai ales la tipicitatea vinurilor. În plus, prin proprietăţile bactericide şi antioxidante protejează culoarea şi gustul vinurilor, în special a celor roşii.

Compuşii fenolici provin din diferite părţi ale strugurilor şi se extrag în procesul de vinificaţie. Cantitatea şi structura compuşilor fenolici din vin depinde de soiul din care provine şi de tehnicile de elaborare şi conservare a vinului.

Structura compuşilor fenolici variază foarte mult în cursul maturării şi învechirii vinurilor. Macromoleculele fenolice nu se pot studia prin metode clasice de analiză, acestea fiind mai bine adaptate pentru determinarea fenolilor simpli, de aceea modificările survenite în timpul evoluţiei vinului nu sunt prea bine cunoscute.

Acizii fenolici se găsesc în cantităţi mici în vin, fiecare acid găsindu-se în concentraţii cuprinse între 10 şi 30 mg/l în vinurile albe şi 100-200 mg/l în cele roşii. Aceşti compuşi se află în struguri sub formă de esteri. În timpul elaborării şi păstrării vinurilor are loc o hidroliză lentă a esterilor, determinând eliberarea acizilor fenolici în vin, care pot rămâne sub formă liberă sau se pot combina ulterior cu alte substanţe prezente în vin. Astfel, acizii benzoici se găsesc în formă liberă, în special în vinurile roşii, ca urmare a hidrolizei antocianilor la căldură. Acizii cinamici se află în vin sub formă de combinaţii şi cu acidul tartric (acid p-cumariltartric, cafeiltartric şi feruliltartric) sau cu antocianii monoglucozidici, când formează antociani acilaţi, prin esterificarea acidului p-cumaric sau acidului cafeic cu glucoza din antociani. Aceşti compuşi au proprietăţi antiseptice.

În soluţie hidroalcoolică acizii fenolici sunt incolori, dar pot deveni bruni prin oxidare. Ei nu au gust sau miros, dar sunt precursori ai fenolilor volatili în care se transformă sub acţiunea microorganismelor. Fenolii volatili se mai extrag şi din lemnul butoaielor, prin degradarea ligninei.  Cumarinele pot fi considerate derivaţi ai acizilor cinamici esterificaţi intramolecular cu un -OH fenolic la carbonul adiacent (din poziţia alfa) faţă de carbonul substituit cu lanţul hidrocarbonat. Cumarinele se găsesc în lemnul de stejar de unde pot trece în vinul maturat la butoi. Cantităţile de cumarine deşi sunt foarte mici (câteva  g/l) sunt suficiente pentru a fi detectate organoleptic. In formă liberă cumarinele au gust acid, iar sub formă de heterozide au gust amar. În vinurile  roşii, limita de detecţie a gustului amar al cumarinelor este de 3 g/l.m [13].

În struguri, vin şi lemn de stejar se mai găsesc şi nişte polifenoli mai complecşi, din familia stilbenilor, care au cicluri benzenice legate printr-o punte etanică -CH₂-CH₂- sau etenică -CH=CH-. Rezveratrolul este unul din aceşti compuşi stilbenici, produs de către vie ca răspuns la atacul mucegaiului (Langcake 1981) şi este localizat în pieliţele boabelor de strugure, fiind extras prin vinificaţia în roşu în cantităţi de 1-3 mg/l. S-a descoperit recent că rezveratrolul este benefic pentru sănătate. In Vitis vinifera se poate găsi şi sub formă de oligomeri. La aceşti compuşi se mai poate adăuga tirosolul (alcool p-hidroxifeniletilic) care este un compus cu funcţie fenol. Ribereau-Gayon şi Sapis (1965) au arătat că tirosolul este un constituent normal al vinurilor. El se formează în timpul fermentaţiei alcoolice din aminoacidul corespunzător, numit tirozina. Concentraţia acestui compus este de 22-29 mg/l. de aici lipsesc pigmenţii-flavone, etc… fără contact cu pieliţele există numai 1-3 mg/l. Heterozidele flavonice din struguri sunt hidrolizate în timpul vinificării, astfel că în vinurile roşii se găsesc trei agliconi sub formă liberă (kaempferolul, quercitina, miricetina ). Concentraţia lor este de câteva zeci de mg/l. În vinurile albe, pigmenţii din aceasta grupă se găsesc numai sub formă de urme.

Antocianii sunt pigmenţii specifici vinurilor roşii şi roze. Ei se găsesc în cantitate de 200-500 mg/l în vinurile roşii şi se reduc la jumătate în timpul primului an de păstrare, după care se stabilizează la conţinuturi de 200 mg/l. Mecanismele care determină reducerea lor cantitativă sunt hidroliza enzimatică a antocianilor, cu formare de antocianidine instabile, şi reacţiile de condensare. Oricum, conţinuturile reduse de antociani din vinurile vechi arată că aceşti compuşi participă numai în mică măsură la realizarea culorii acestor vinuri.

Antocianii prezintă proprietăţi fizico-chimice caracteristice, care determină o evoluţie specifică a vinurilor. Aceste proprietăţi sunt următoarele:

• În mediu slab acid forma roşie a antocianelor se găseşte în echilibru reversibil cu forma incoloră; poziţia echilibrului depinde de pH;
• Ionii bisulfit se condensează cu antocianii, formând compuşi incolori. Această reacţie este mai puţin importantă în vinurile acide deoarece, în aceste condiţii, forma bisulfit trece sub formă de acid liber. Această proprietate explică decolorarea vinurilor după sulfitare. Reversibilitatea reacţiei face ca intensitatea colorantă a vinurilor să crească progresiv pe măsură ce scade SO₂ liber;
• Prin reducere antocianii se decolorează, reacţia fiind reversibilă. Acest fapt explică slaba coloraţie a vinurilor roşii la sfârşitul fermentaţiei alcoolice, care este un proces reducător. Prin oxidarea progresivă a antocianilor (fenomen foarte rapid în butoaie de 225 l) intensitatea colorantă a vinurilor creşte.

Antocianii care au două grupări hidroxil în poziţia orto pe ciclul benzenic lateral (petunidina, delfinidina, cianidina) formează  complecşi cu metalele grele (fier şi aluminiu) care au o coloraţie albastră. Această proprietate se manifestă în cazul casării ferice a vinurilor roşii, când se formează complecşi insolubili ai fierului cu materia colorantă şi cu taninurile. Oxidarea progresivă a fierului feros la fier feric aduce după sine formarea acestor complecşi.

În cazul vinului produs din Vitis vinifera, etanolul inhibă efectul flavonoidelor asupra culorii antocianilor (copigmentarea), în timp ce antocianii acilaţi dispar rapid după câteva luni de la încheierea fermentaţiei. Astfel, în vin găsim numai cele 5 monoglucozide ale antocianidinelor, între care predominantă este malvidina. In funcţie de vârsta vinului şi de soiul utilizat pentru vinificare, concentraţia antocianilor liberi diferă mult, fiind de 100 mg/l în vinurile tinere de Pinot şi 1500 mg/l la cele de Cabernet-Sauvignon, scăzând însă rapid în timpul maturării şi învechirii vinurilor, rămânând în limita a 0-50 mg/l. Această scădere a antocianilor liberi se datorează condensării lor cu taninurile din vin, când se formează nişte molecule colorate mai stabile, care vor da de aici înainte culoare vinurilor, dar care însă nu mai pot fi dozate prin metodele actuale.

O mică parte din antociani dispare prin degradare ca urmare a acţiunii oxigenului, luminii şi temperaturii sau prin precipitarea materialelor coloidale. Dispariţia lor determină o diminuare a culorii vinului, fiind deci un dezavantaj.

Compuşii a unei soluţii de antociani, aceştia prin încălzire la 100 ⁰C  se decolorează, efectul fiind cu atât mai mare cu cât timpul de încălzire este mai lung. O soluţie astfel încălzită nu-şi va mai recăpăta culoarea originală, chiar dacă se revine la condiţiile iniţiale, deoarece antocianii degradează chimic, rezultând acizi benzoici, cinamici, dihidroflavonoli, catechine etc., din care nu se mai regenerează antocianii originali. S-a constatat de asemenea că malvidina, care este un constituient principal al compuşilor coloranţi din vin, este mult mai sensibilă la degradarea termică, decât este de exemplu cianidina (Galvin, 1993). Din acest motiv, la maturarea şi învechirea vinului, şi mai ales la pasteurizarea sau concentrarea mustului trebuie să luăm în considerare efectele temperaturii asupra culorii, alegând o metodă care să protejeze cât mai mult posibil culoarea [12].

Antocianii se degradează  şi prin oxidare, reacţia fiind favorizată de prezenţa alcoolului şi a luminii. Malvidina rezistă mai bine ca cianidina la oxidările care însoţesc maturarea vinurilor roşii (Laborde, 1987).

Taninurile din vin sunt taninuri condensate.La sfârşitul macerării-fermentării raportul între moleculele cu grade diferite de condensare variază în funcţie de soi şi de condiţiile de vinificare. În timpul evoluţiei vinului are loc o reducere a fracţiei taninice cu grad mediu de condensare (complecşii tanin-antociani, tanin liber, catechine, procianidine puţin polimerizate) şi o creştere a fracţiei taninice condensate (taninuri condensate, complecşi tanin-proteine sau tanin-polizaharide) (Glories, 1978). Condiţiile de oxidare ale vinului orientează transformarea către produşi specifici. Oxidarea puternică a vinului face ca procianidinele să reacţioneze sub formă de semichinone şi să formeze polimeri care precipită (flobafene), iar oxidarea menajată conduce le formarea taninurilor cu grad mare de condensare. Aceste fracţii taninice influenţează caracteristicile organoleptice ale vinurilor. Diferenţe nete se manifestă între două grupe de fracţii taninice şi anume între fracţiile alcătuite din complecşi tanin-proteine pe de o parte şi taninurile condensate pe de altă parte.

După îmbuteliere, transformarea taninurilor decurge foarte încet. Dacă vinul este bogat în forme condensate, cu reactivitate redusă, evoluţia va fi lentă şi va conduce la obţinerea unor forme foarte condensate. În vinul cu taninuri puţin condensate, care sunt forme cu rectivitate mare, reacţiile vor fi mai rapide şi ele nu vor conduce la obţinerea de forme foarte condensate, ci la precipitate. Aceste mecanisme pot explica comportamentul diferit al vinurilor în timpul evoluţiei lor.

Compuşii fenolici joacă un rol esenţial asupra gustului vinurilor roşii, fiind responsabili de anumite caractere gustative pozitive, dar şi negative. De exemplu corpul vinului, structura sa de ansamblu, plinătatea sunt caracteristici organoleptice ale vinurilor roşii de mare marcă, în timp ce, dimpotrivă, amăreala, asprimea, duritatea, astringenţa şi subţirimea reprezintă defecte de evitat, fiind puţin compatibile cu vinurile de calitate.

Taninurile reacţionează cu glicoproteinele din salivă  (mucina) şi cu proteinele din pereţii bucali, modificându-le starea şi proprietăţile de lubrifiere. In funcţie de natura şi concentraţia acestor taninuri, rezultatul poate fi o senzaţie armonioasă, de fond, sau din contra, poate fi o senzaţie de agresivitate, ori poate apare chiar o amăreală către sfârşitul degustării sau după înghiţire .

Cantitatea substanțelor colorante, pe măsura coacerii strugurilor treptat se mărește, ajungînd la soiul Cabernet pînă la 2,5 – 2,8 % masă de pieliță, iar la soiul de Saperavi pînă la 5 – 6 % în pieliță și 250 – 260 mg/dm³ în mustuială. Coacerea strugurilor în mare măsură influențează acumularea substanțelor colorante. În boabele roșii culoarea apare cu mult mai tîrziu. Seceta foarte mult influențează componența substanțelor fenolice, aproape că nu influențează substanțele colorante. În anii secetoși componența taninelor în boabele aceluiași soi de struguri se mărește de trei ori. Unii savanți consideră, că substanțele colorante pătrund în boabe din frunze, alții cred că culoarea o formează însăși boaba.

Rezerva tehnologică de substanțe colorante trebuie să fie egală pentru soiurile puternic colorate – Saperavi, Cabernet-Sauvignon – nu mai puțin de 600 mg/dm³, pentru cele mediu colorate – nu mai puțin de 450 mg/dm³. Soiurile slab colorate, Pinot negru, se recomandă prelucrarea lor numai la obținerea vinurilor roze și albe.

 

2. Determinare sumei compuşilor fenolici prin metoda spectrofotometrică cu utilizarea reactivului Folin-Ciocalteu.

 

Principiul metodei: Reactivul Folin-Ciocalteu oxidează grupele fenolice din vin, restabilinduse întun complex de culoare albastră, intensitatea culorii căreia este direct proporţională cu concentraţia substanţelor fenolice.

Materiale: Spectrofotometru;

Balon pentru distilare;

refrigerent cu bule;

Baie cu nisip.

Reactive: Reactivul Folin-Ciocalteu: În balonul pentru distilare cu volumul de 1dm³ se toarnă 700 cm³ de apă distilată, se dizolvă în ia 100 g de volframat de sodiu şi 25 g de molibdat de sodiu, se adaugă 50 cm³ de acid ortofosforic conc. şi 100 cm³ de acid clorhidric conc., se pune pe baia de nisip şi se fierbe timp de 10 h cu refrigerent reversibil, după ce se adaugă 150 g de sulfat de litiu, 3-4 picături de brom şi se fierbe fără refrigerent încă 15-18 min. pentru înlăturarea surplusului de brom, se răceşte pînă la temperatura de (20±0,5)°C se trece cantitativ într-un balon cotat de 1 dm³ şi se aduce la cotă cu apă distilată(reactivul se păstrează în sticlă întunecată în frigider); Carbonat de sodiu, soluţie cu concentraţia masică 200g/dm³; Soluţie de acid galic(0,03 mg/dm³): Într-un pahar cotat de 500 dm³ se toarnă 50 cm³ de etanol, se aduce pînă la cota de 400 cm³ cu apă distilată, apoi se introduce în pahar electrozii pentru determinarea pH-ului şi se acidulează cu acid clorhidric pînă la pH 3,20 – 3,25, soluţia obţinută se trece cantitativ într-un balon cotat de 500 dm³ în care se dizolvă 15 mg de acid galic şi se aduce pînă la cotă.

Construirea graficului de calibrare. 1;2;5;10;20; cm³ soluţie de acid galic se toarnă respectiv în 5 baloane cotate de 100 cm³. Într-un balon se introduce 1 cm³ de H₂O(soluţia de referinţă). În fiece balon se adaugă cîte 1 cm³ de reactiv Folin-Ciocalteu, 15-20 cm³ de apă distilată, 10 cm³ Na₂CO₃ şi se aduce pînă la cotă cu H₂O dist., şi se amestecă(de respectat secvenţa adăugării reactivelor!).

Peste 30 min. se măsoară absorbanţa soluţiei în cuve de 10 mm la lungimea de undă 670 nm comparativ cu soluţia de referinţă.

După rezultatele, absorbanţelor optice obţinute se construieşte graficul de calibrare.

Modul de lucru. Înainte de-a efectua măsurarea, vinul se centrifughează 15-20 min. cu viteza de 6000 rot/min. Dacă vinul este limpede, cu luciu, nu este necesar deal centrifuga. Vinurile roşii se dizolvă de 5 ori.

Într-un balon cotat de 100 cm³ introducem 1 cm³ de mostra studiată, 15-20 cm³ de H₂O_(dist),1 cm³ de reactiv Folin-Ciocalteu, 15-20 cm³ de apă distilată, 10 cm³ Na₂CO₃ şi se aduce pînă la cotă cu H₂O dist., şi se amestecă(de respectat secvenţa adăugării reactivelor!).

Peste 30 min. se măsoară absorbanţa soluţiei în cuve de 10 mm la lungimea de undă 670 nm comparativ cu soluţia de referinţă se pregăteşte la fel numai că în loc de vin se pune 1 cm³ de H₂O_(dist).

Calcule. Concentraţia masică a substanţelor fenolice(C, mg/dm³) după acidul galic se determină după formula:

C=C₁*K,

Unde   C₁ – Concentraţia substanţelor fenolice, găsită după graficul de calibrare,

K – Coeficientul de diluţie a vinului.

Rezultatele se rotunjesc pînă la număr întreg.

Ca rezultat final se ia media aritmetică a 2 determinări paralele.

 

Determinare a concentraţiei masice a substanţelor colorante (antociane)

 

Principiul metodei. Constituie în stabilizaţia culorii vinului(mustului) co alcool etilic acidulat pînă la pH 1-2 şi măsurarea, ulterioară, a caracteristicelor optice.

Materiale.

 Spectrofotometru;

Balon centrifugă (1500 rot/min),

picnometru cu volumul de 25 cm³ .

Reactive. Acid clorhidric concentrat; Alcool etilic 96 % vol., acidulat cu acid clorhidric pînă la pH 1-2.

Modul de lucru. Turnăm 3 cm³ de mut sau vin în picnometru de 25 cm³. Apoi adăugăm 12,5 cm³ de Etanol acidulat(pînă la concentraţia de 50% vol. de alcool), şi 3 picături de HCl(conc). Aducem volumul lichidului pînă la cotă cu apă distilată şi îl amestecăm. Apoi centrifugăm soluţia obţinută timp de 15 min la 1500 rot/min, după ce măsurăm absorbanţa optică la lungimea optică 530 nm în cuve cu traiectul optic de 1 mm. Ca soluţie de referinţă se utilizează apa distilată.

Calcule

C= A*1056,7

C – conţinutul de antociane.

A – absorbanţa.

Întrebări şi sarcini.

1. De identificat formula structurală a următoarelor substanţe.

Malvidină; acizii galic, sirginic, vanilic; kaepferol-3-glucozid, catechină.

2. Care substanţe sunt responsabile de culoarea vinului?
3. Care este rolul substanţelor fenolice în vin?
4. Principiul metodei de determinare a substanţelor fenolice?
5. Principiul metodei de determinare a substanţelor antociane?
6. Mecanismul reacţiei de oxidare a antocianelor, fenolilor?