Выбор штаммов-продуцентов полигидроксиалканоатов (ПГА) и исследование их свойств

 

1.6 Извлечение ПГА из клеток

Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток:

1. Сырую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хлороформа и оставляют на 15-20 часов в ёмкости при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а остаток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления полноты экстракции. Объединенные хлороформные экстракты полимера и липидов концентрируют, добавляют двойной объем спирта или гексана. Выпавший в осадок полимер отделяют от смеси растворителей.
2. Предварительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата Сокслет, и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов.
3. Выделение полимера заключается в удалении из биомассы неполимерных компонентов и получении гранул полимера. Для этого обычно обрабатывают биомассу детергентами, такими как додецилсульфат натрия, ЭДТА или лизирующими ферментами. Такое извлечение особенно эффективно для выделения полимера из клеток с высоким его содержанием. Однако чаще всего гранулы полимера, выделенные после химической или ферментативной обработки биомассы, загрязнены остатками бактериальных клеток и требуется дополнительная экстракция полимера и его осаждение. [4]
4. Способ заключается в экстракции ПГА из биомассы, по крайней мере, одним растворителем, например ацетоном, этилацетатом, толуолом, ксилолом и их смесью. Биомасса представляет собой растительный материал, содержащий масло или биомассу бактерий. Осаждение ПГА из экстракта осуществляют с помощью осадителя. Представлен также получаемый полимер, температура плавления его около 80◦С и выше. Способ обеспечивает  получения  высокочистых биопластиков из биологических источников. Такие растворители ПГА, как ацетон или этилацетат, являются недорогостоящими, безопасными и доброкачественными, а также легкодоступными даже из восстановленных источников. Также считаются менее опасными для окружающей среды, особенно для озонового слоя земли, чем галогенсодержащие соединения.
5. В принципе возможно выделение ПГА методами седиментации. Однако простое гравитационное осаждение в жидкой суспендирующей среде фактически оказывается неприменимым. Скорость осаждения чрезвычайна низка. Кроме того, такое медленное осаждение легко нарушается Броуновским движением мелких частиц ПГА. Также продолжительные периоды времени, требуемые для осаждения, создают проблему, связанную с бактериальным загрязнением и последующим биоразложением суспензии частиц.
6. Способ выделения ПГА из клеток заключается в  двухстадийной последовательной экстракции  масла и ПГА.  Вначале масло выполняет функции смешивающегося со-растворителя, промотирующего экстракцию ПГА.  Однако после удаления летучего растворителя ПГА масло становится эффективной суспендирующей средой для осаждения ПГА благодаря его ограниченной ПГА-сольватирующей способности. Суспензия полимерного твердого вещества в жидком нерастворителе  обладает улучшенной способностью к переработке. Устраняется проблема гелеобразования. [12]

 

1.7 Применение ПГА

ПГА, являясь биоразлагаемыми полимерами, могут заменить синтетические полимеры при производстве разнообразных пластмассовых изделий, отходы которых накапливаются в окружающей среде.

При изготовлении изделий из ПГБ не требуется введение больших количеств различных добавок (стабилизаторы, наполнители, красители и пр.), поскольку они хорошо формируются из растворов и расплавов.

Сам процесс биосинтеза практически не дает побочных  продуктов, которые не могли бы быть использованы, производство ПГБ является безотходным. Низкая энергоемкость уникальна и заслуживает внимания в условиях энергетического кризиса.

Из ПГБ хорошо получаются пленки различной толщины, листы, нити, а также полые формы и упаковочная тара в виде различных коробок, пакетов, бутылей и пр.

ПГБ можно использовать в медицине. Имеются сведения о получении прочного рассасываемого хирургического материала, элементов для хирургии опорно-двигательного аппарата.

Стерильные вязкие растворы ПГБ в виде гелевых аппликаций накладываются на раневые поверхности и после испарения растворителя дают вместо повязки качественные покрытия. Такие пленки в своей структуре могут содержать включения лекарственных веществ, которые постепенно высвобождаются по мере рассасывания пленки. На основе ПГБ возможно получение диализных мембран.

Для пролонгирования действия лекарственных средств ПГБ используется в качестве основы или матрицы при их изготовлении. Смешением и прессованием можно получать таблетки любого размера, разрушающиеся с заданной скоростью.[7]

 

 

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Тема: Выбор штаммов-продуцентов полигидроксиалканоатов (ПГА) и исследование их свойств.

Цель – поиск штаммов микроорганизмов-продуцентов и выделение ПГА из биомассы клетки.

Задачи:

• Информационный поиск по данной теме;
• Выбор штамма-продуцента ПГА из коллекции УЛК;
• Выделение чистой культуры микроорганизма из накопительной культуры;
• Подобрать необходимую среду и условия для роста и развития культур;
• Описание морфологических свойств;
• Выбрать методику  выделения ПГА;
• Выбор условий для хранения культур.

2.2 Использованные методы при данной работе:

• Омолаживание музейной культуры;
• Скрининг  штаммов микроорганизмов;
• Микробиологические методы: пересев с твердой питательной среды на жидкую, смыв, пассаж, разбавление;
• Микроскопия под иммерсией;
• Метод выделения чистой культуры – метод Коха;
• Посев с помощью методы истощающего мазка;
• Количественное определение с помощью ИК-спектрофотометрии.

2.3 Ход работы

Было проведено омолаживание двух (1- Г NCT 1n 7.03.03.; 2- 6.08.01;)  музейных культур, которые хранились на косяке под маслом, на  МПА.  Для получения накопительной культуры была использована среда М9 с добавлением глюкозы. Состав среды М9 (г/л): Na2HPO4 – 6 г, K2HPO4 – 3 г, NaCl – 0,5 г, NH4Cl - 1 г, после автоклавирования добавлялось 1 мл  1 М  раствора CaCl2, 2мл 1 М раствора MgSO4*7Н2О, 10 мл 20% раствора глюкозы. Весь процесс омолаживания представлен в Приложении 1.

Для выделения чистых культур был выполнен метод  Р. Коха, который заключается в посеве накопительной культуры на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри. Посев был произведен с помощью микробиологической петли методом истощающего мазка. Чашки помещают в термостат в течение 2-7 суток. В результате выросло два вида колоний.

Колония №1:

• Форма колонии – круглая;
• Размер колонии – 2-4 мм;
• Поверхность колонии – гладкая;
• Цвет колонии -  светло-кремовые;
• Край колонии - слегка волнистый;
• Прозрачность колонии – непрозрачная;
• Структура – однородная;
• Консистенция – плотная.

 

Колония №2:

• Форма колонии – ризоидная;
• Размер колонии – точечная;
• Поверхность колонии – гладкая;
• Цвет колонии -  безцветная;
• Край колонии - ризоидный;
• Прозрачность колонии – полупрозрачная;
• Структура – однородная;
• Консистенция – плотная

Затем был сделан отсев каждой культуры на разные чашки Петри с МПА, с целью разделения колоний и выделения чистых культур. Для определения ПГА в клетках микроорганизмов был сделан микроскопический анализ (Приложение 2). Далее культуры были отсеяны на косяки.

Для учёта численности микроорганизмов были сделаны измерения оптической плотности в зависимости от концентрации азота и источника углерода, в данных условиях им являлась глюкоза. Использовался  фотоэлектроколориметр при длине волны 670 нм  (Приложение 3).

Для накопления биомассы культуры был сделан пересев на чашки Петри на плотную агаризованную среду М9 без азота, так как полигидроксиалканоаты являются резервными веществами клетки и накапливаются при избытке субстрата. Чашки помещались в термостат для роста культур. По истечению 3 недель рост наблюдался незначительный.

Для количественного определения ПГА проводили ИК-спектрофотометрию (Приложение 4).

На хранение культуры была отсеяна на косяки и помещена в холодильник.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Сделан литературный обзор по данной теме;
2. В качестве продуцентов ПГА могут выступать различные микроорганизмы, скрининг будет продолжаться далее;
3. Подобрана оптимальная среда для роста и развития культур;
4. Было проведено омоложение музейных культур;
5. Сделаны количественные анализы ПГА в клетках;
6. Определены морфологические свойства культур.

Следующие этапы:

• Выделение полимера из клетки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература:

1.  Волова Т.Г. Полигидроксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры для медицины. Красноярск: Платина, 287 стр., 2006 г.

2. Информационный источник: «Биоразлагаемые полимеры в центре внимания».

3. Синтез полиэфиров гидроксипроизводных жирных кислот (полигидроксиалканоатов) и характеристика состава липидов сине-зеленых, светящихся и водородокислящих прокариот. Калачева Г.С., Диссертация, Красноярск, 2012 г.

4.  Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилбактерии. 2010 г.

5.  Староверова О.В., Ольхов А.А., Власов С.В. Ультратонкие волокна на основе биополимера полигидроксибутирата (ПГБ). //Вестник МИТХТ, 2011 г., Т.6, №6, Стр. 120-123.

6. Николаева Д.А. Биосинтез поли-3-гидроксибутирата разной молекулярной массы культурой Azotobacter Chroococcum и его биодеградация. Москва, 2004 г.

7.  Бояндин А.Н., Калачева Г.С., Родичева Э.К., Волова Т.Г. Продукция полигидроксиалканоатов светящимися бактериями. // Институт биофизики СО РАН, Красноярск.

8. Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс] :лаб. практикум / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. – Красноярск : ИПК СФУ, 2009 г., Стр. 75.

10. Characterization of crude glycerol from biodiesel production from multiple feedstocks. Thompson  J.C.,  He  B.B. Appl. Engin. in Agricul., 2006, 22(2):261-265.

11.   Егоров Н.С.  Практикум по микробиологии.  Издательство Московского университета, 1976 г.

12. Микробиологический синтез материалов нового поколения – полигидроксиалканоатов (ПГА).  Сырвачева Д.А., научный руководитель – профессор Волова Т.Г., Сибирский федеральный университет.

13. Синтез биотехнологичных сополимеров 3 и 4 полигидроксибутирата в пользу окружающей среды. Синельникова А.М., научный руководитель – д. б. н., профессор Волова Т.Г., Сибирский федеральный университет.

13. Антипов Е.М., Ребров А.В., Некрасов Ю.П., Гордеев С.А., Антипов А.Е. Высоко ориентированные волокна биодеградируемых полигидроксиалканоатов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение

Приложение 1. Процесс омолаживания двух музейных культур из коллекции УЛК.

 

Приложение 2. РЭМ фотографии клеток R. eutropha B5786 из различных фаз роста периодической культуры в период накопления П3ГБ в автотрофных условиях: а – 4-часовая культура, клетки без полимера (проба I); б– 10-часовая культура, П3ГБ – 26 % (начало линейной фазы); в –40-часовая культура, П3ГБ - 54% (середина линейной фазы, проба II); г – 72-часовая культура, П3ГБ – 86 %; РЭМ фотография гигантской клетки (1) и нормальной клетки (2) (д) и фрагмент гигантской клетки (е) R. eutropha B5786 из стационарной фазы роста; гетерогенная по размерам клеток и гранул в них культура из фазы деградации полимера (104-часовая культура, проба IV)

 

 

Фотография выросших колоний на среде без источника азота под микроскопом с иммерсией.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложение 3.

Зависимость оптической плотности от времени (в часах) в среде, где концентрация источника азота (NH4Cl) составляет 0,1% (0,1г на 100 мл)

 

Зависимость оптической плотности от времени (в часах) в среде, не содержащей источник азота (NH4Cl).