Выбор штаммов-продуцентов полигидроксиалканоатов (ПГА) и исследование их свойств

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего  профессионального образования

«Пермский национальный исследовательский      политехнический университет»

Кафедра химии и биотехнологии

 

 

 

 

 

 

 

Отчет  по учебно-исследовательской практике

По теме: «Выбор штаммов-продуцентов полигидроксиалканоатов (ПГА) и исследование их свойств»

 

 

 

Выполнила работу:

Студентка гр. БТ-11 Фадеева О.Ю.

Научный руководитель: Козлова Г.А.

 

 

 

Г. Пермь, 2014 г.

Содержание:

Введение…………………………………………………………………………………………………………3

1. Теоретическая часть……………………………………………………………………………..4

1.1 Что такое полигидроксиалканоаты……………………………………….……..4

1.2 Микроорганизмы-продуценты………………………………………………….….6

1.3 Субстраты для биосинтеза ПГА………………………………………………………7

 1.4 Биохимические основы синтеза полигидроксиалканоатов……..….8

1.5 Культивирование микроорганизмов……………………………………………..9

1.6 Извлечение полигидроксиалканоатов из клеток………………………..10

1.7 Применение полигидроксиалканоатов……………………………………..…12

2. Практическая  часть…………………………………………………………………………………….13

             2.1 Цель и задачи………………………………………………………………………………..13

            2.2 Использованные методы при данной работе……………………………..13

             2.3  Ход работы……………………………………………………………………………………14

 Заключение………………………………………………………………………………………………….…16

Список литературы…………………………………………………………………………………..…....17

Приложение………………………………………………………………………………………….……..…19

 

           

 

 

 

 

 

Введение

В связи с глобальной экологической проблемой утилизации не разлагаемых в природе синтетических пластмассовых изделий (полиэтилен, поливинилхлорид, полипропилен), составляющих 40% бытового мусора, все более актуальны разработка и производство биодеградабельных   пластиков для нужд промышленности, медицины, сельского хозяйства и нанотехнологий.[1]Еще до «расцвета» пластика (в 1925 году) установили, что полигидроксимасляная кислота – это питательное вещество и среда для хранения микроорганизмов. Под их воздействием  полимер на основе гидроксимасляной кислоты полностью разлагается до углекислого газа и воды, не оказывая действия на окружающую среду. Поли-3(4)-гидроксибутират и его сополимеры, которые относятся к семейству микробных полигидроксиалканоатов (ПГА), являются запасом углерода и энергии в клетках микроорганизмов.  По своим базовым характеристикам эти полимеры близки к синтетическим, но обладают рядом уникальных свойств, главными из которых являются биосовместимость с живой тканью организма и биодеструкция во времени. Так, пластины и волокна разрушаются в тканях организма в течение нескольких месяцев, а для биодеградации пленок, внесенных в почву, требуется всего несколько недель. Конечным продуктом биодеградации в почве является двуокись углерода, а в живом организме – 3-изомасляная кислота, которая является одним из компонентов крови. [13]

 

 

 

 

 

 

 

1. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Что такое полигидроксиалканоаты

Полигидроксиалканоаты (polyhydroxyalkanoates – ПГА) представляют собой алифатические полиэфиры. К числу наиболее значительных представителей этого семейства относятся полигидроксибутират (polyhydroxybutyrate – ПГБ) и полигидроксивалерат (olyhydroxyvalerate – ПГВ).[2] ПГА - это резервные внутриклеточные макромолекулы, синтезируемые прокариотами сложным многоступенчатым путем, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты, ключевыми при этом являются: β-кетотиолаза (β-КТ), ацетоацетил-КоА-редуктаза (АА-КоА-редуктаза) и ПГА-синтаза.[3]  ПГА обладают рядом уникальных свойств, включая совместимость с животными тканями, оптическую активность, пьезоэлектрические и антиоксидантные свойства. Основные структуры ПГА представлены следующим образом:

100 – 30 000

N=1 R = водород-поли (3-гидроксипропионат)

      R = метил-поли (3-гидроксибутират)

      R = этил-поли (3-гидроксивалерат)

      R = пропил-поли (3-гидроксигексаноат)

      R = пентил-поли (3-гидроксиоктаноат)

      R = нонил-поли (3-гидроксидодеканоат)

N=2 R = водород-поли (4-гироксибутират)

N=3 R = водород-поли (5-гидроксивалерат)

         ПГБ – это полиэфир с неполярной гидрофобной природой. Скопление поли-β-гидроксибутирата часто заполняет всю цитоплазму, составляя более 85% массы клетки. В состав полимера входят углерод (81%), водород (7,03%), кислород(37,16%). Гидролиз полимера приводит к образованию β-гидроксимасляной   и кротоновой кислот; последняя может превращаться в D(-)-β-гидроксимасляную кислоту.[7]

          ПГБ демонстрирует высокую прочность и способность к биоразложению в естественных климатических условиях, обладает высокой температурой плавления и кристаллизации, а также умеренную гидрофильность и не токсичность (при биодеструкции разлагается на СО2 и воду).  Гомогенный ПГБ по механическим свойствам сходен с полипропиленом, но обладает лучшими газо-барьерными свойствами, большей устойчивостью к УФ-облучению, хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью, низкой проницаемостью для водяного пара. Благодаря этим свойствам, в особенности, биосовместимости и биоразлагаемости, ПГБ имеет тенденцию к замещению полиолефинов в биомедицинских целях, а также для упаковки. Но ряд его свойств (термическая стабильность, газопроницаемость, пониженная растворимость и стойкость к горению) недостаточны для широкомасштабного применения.[5] Накапливается полимер в клетках в виде гранул, которые образованы плотно упакованными тяжами, ограниченными фосфолипидными оболочками с включенными в них белками. Диаметр гранул колеблется от 0,2 до 0,7 мкм. Наличие ПГБ в клетках позволяет микроорганизмам переносить неблагоприятные условия роста. [7]

         Полимер хорошо растворяется в хлорсодержащих органических растворителях, таких как хлороформ, трихлорметан, трихлорэтан, но не растворяется в спиртах, ацетоне, гексане, воде. Эти свойства полимера используются при его отделении от липидов после извлечения из бактериальных клеток.[4]Молекулярная масса  варьирует в зависимости от продуцента и условий культивирования от 50 до 2500 кДа.

          Еще одним биоразлагаемым, биосовместимым и термопластичным полимером является полилактид (ПЛА) – полимер молочной кислоты, продуцируемый в настоящее время из растительного сырья (кукуруза, сахарный тростник). [1]

Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной C-цепи, от C4 до C12 и выше. Мономерный состав ПГА определяет их базовые свойства. Однако синтез гетерополимерных ПГА (т.е. полимеров, образованных мономерами с различной длиной C-цепи) - сложная технологическая задача, решение которой возможно несколькими путями. Первый заключается в поиске новых штаммов - продуцентов ПГА и создании специализированных условий для их выращивания. Второй путь предполагает конструирование генетически модифицированных организмов, в которых объединяют гены, контролирующие синтез ПГА из различных природных штаммов. Существуют недостатки штаммов-продуцентов гетерополимерных ПГА, которые заключаются в том, что продуценты являются генетически модифицированными организмами, требуют для роста специализированных дорогостоящих сред, а также характеризуются нестабильностью в процессе культивирования и возможностью снижения или утраты способности синтезировать ПГА требуемого состава.

 

1.2 Микроорганизмы-продуценты

Источники, из которых экстрагируют ПГА, включают такие одноклеточные организмы, как бактерии или грибы, а также высшие организмы, такие как растения. Особенно предпочтительными растениями являются соя, картофель, кукуруза и кокосовые растения, подвергнутые обработке методами генной инженерии с получением ПГА. (10) . Список микроорганизмов, способных синтезировать ПГА  с различной эффективностью, насчитывает свыше 300 организмов, среди которых – аэробные и анаэробные бактерии, гетеротрофы, хемооргано- и хемотрофы, фототрофные прокариоты, олиготрофные полипростековые бактерии, архебактерии, анаэробные фототрофные бактерии, Г-, Г+, и другие.(3) Среди продуцентов ПГА известны различные прокариотические микроорганизмы, относящиеся к различным таксономическим группам, способные расти на различных субстратах (сахарах, органических кислотах, отходах сельского хозяйства и промышленности) и синтезировать эти полимеры [8). Однако для промышленного применения выделено несколько высокопродуктивных микроорганизмов. Это водородокисляющие бактерии Alcaligenes latus, Alcaligenes eutrophus (переименованные из Ralstonia и Wautersia eutropha, в настоящее время отнесенные к роду Cupriavidus), азотфиксаторы Azotobacter vinelandii (до 74 масс.% от массы СВ), Hydrogenjmonas (до 80 – 86%), метилотрофы Methylomonas, Methylobacterium organophilum, синтезирующие, в основном, полимер 3-гидроксимасляной кислоты (3-гидроксибутират (3-ПГБ)), который является наиболее изученным и распространенным представителем ПГА. Среди метилотрофов для промышленного производства ПЛА перспективны метилотрофные дрожжи Candida boidinii. 3-ПГБ - это высококристалличный (степень кристалличности - свыше 70%) термопласт, высокая биосовместимость которого базируется на том, что гидроксимасляная кислота является естественным метаболитом клеток и тканей высших организмов и человека. [9]

3. Субстраты для биосинтеза ПГА

             Тип основного ростового субстрата, используемого для получения ПГА, определяется исходя из физиолого-биохимических свойств   продуцентов и экономической целесообразности выбранной стратегии с учетом области применения полимера. В связи с тем, что ПГА перспективны для использования в медицине, фармакологии, пищевой промышленности, сельском и коммунальном хозяйстве, масштабы производств полимеров могут быть самыми разными, от десятков килограммов (для медицины и фармакологии), до сотен тысяч тонн в год. Поэтому требования, предъявляемые к качеству и стоимости сырья для различных объемов производств и областей применения, также различны. Потенциально сырьем для получения ПГА могут быть самые разные субстраты с различными степенью восстановленности, энергосодержанием и, конечно, стоимостью. Среди субстратов - индивидуальные соединения (сахара различной природы, спирты, кислоты, углекислота, углеводороды) и комплексные субстраты, включая отходы промышленных и сельскохозяйственных производств.

           Для получения полигидроксиалканоатов возможно привлечение  разнообразных субстратов. Среди известных - индивидуальные соединения (углекислый газ и водород, сахара, спирты, органические кислоты), отходы спиртовой, сахарной, гидролизной промышленности, производства оливкового и пальмового масла и др., а также необычные субстраты, включая токсичные. Например, установлена возможность синтеза ПГА на плохо растворимом и токсичном октане и октаноате, бензоате натрия и феноле, метакриловой кислоте.

В настоящее время все чаще появляются работы, рассматривающие в качестве субстрата для биотехнологических производств угли и продукты их переработки. В связи с огромными запасами и относительно низкой стоимостью данный субстрат потенциально представляет интерес и для будущих крупнотоннажных производств микробных биопластиков.[3]

 

1.4 Биохимические основы синтеза ПГА

На процесс синтеза ПГБ существенное влияние оказывает состав среда.  Изменение в среде соотношения С/N, как правило, очень значительно влияет на соотношение основных и запасных клеточных макромолекул, что является источником для получения разнообразных целевых продуктов биотехнологии.

Накоплению ПГБ внутри клеток при росте на углеводах или на других источниках углерода, например на метаноле, способствует недостаток фосфора или азота. Поэтому образование данного полимера может быть одностадийным процессом, при котором лимитирующим фактором является с самого начала роста определенное питательное вещество. Процесс может быть и двухстадийным, когда микроорганизмы сначала растят в среде, содержащей достаточное количество питательных веществ, для накопления биомассы, а затем переводят в условия, где лимитирующим рост фактором служит какой-либо компонент среды, кроме углерода, что вызывает значительное повышение уровня внутриклеточного ПГБ. [7]

Рост бактерий при обеспеченности азотом на 50 % от потребности сопровождался снижением экономического коэффициента по водороду от 1.12 до 0.85 г/г. При этом внутриклеточная концентрации белка падала до 48 %; практически наполовину сократилось содержание в клетке большинства аминокислот. Доля П3ГБ возросла более чем в 10 раз (до 22 % от сухого веса). Параллельно с увеличением концентрации полимера в лимитированных по азоту клетках отмечено увеличение содержания липидов (на 70 % от исходной величины) и углеводов (на 100 % по сравнению с ростом на полной питательной среде).[3]

Лимитирование роста Hydrogenjmonas азотом, а также кислородом при избытке углерода в среде сопровождается синтезом ПГБ, концентрация которого может превышать 80 масс.% от массы СВ. Особенностью метаболизма Azotobacter является отсутствие влияния концентрации азота на скорость образования полимера, синтез которого усиливается при дефиците кислорода в среде. Высокие концентрации ПГБ (до 80%) получены в клетках хемолитотрофных бактерий Alcaligenes eutrophus Н-16 при гетеротрофном росте бактерий  на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глицерин или ацетат. [7]

1.5 Культивирование микроорганизмов

• Культивирование бактерий проводят в стерильном режиме с использованием литровых колб, заполненных средой Шлегеля на 40-50% по объему на термостатируемой качалке или с использованием автоматизированного ферментационного комплекса BioFlo 110 («New Brunswic», США) объемом 15 л, который позволяет реализовать асептический режим при стабилизации основных параметров культуры (pH, температура, концентрация кислорода и азота в культуре) на минеральной солевой среде следующего состава (г/л): Na 2HPO4•H2O – 9.1, KH2 PO4 – 1.5; MgSO4 H2O – 0.2, Fe3C6H5O7•7H 2O – 0.25, NH4Cl – 1.0. [9]
• Azotobacter поддерживали на среде Эшби. Для достижения сверхсинтеза поли-3-гидроксибутирата в клетках культуру выращивали на среде Берка в условиях избыточного содержания углерода в среде (г/л) : MgSo4*7H2O – 0,4; FeSo4*7H2O – 0,01; Na2MoO4*2H2O – 0,006; цитрат Na – 0,5; CaCl2 – 0,1; KH2PO4*3H2O – 1,05; KH2PO4 – 0,2; сахароза – 40. [10]
• Микроорганизмы выращивались на агаризованной среде Егоровой (24 часа, 25◦С). Для периодического культивирования (36 часов, 28◦С) использовалась минеральная среда, содержащая (г/л) : NaCl (30); MgSO4 (0,2); KH2PO4 (1); Na2HPO4 (6); пептон (5) и глицерин (3).  [7]
• Музейную культуру штамма-продуцента Cupriavidus eutrophus ВКПМ B-10646 суспендируют в жидкой солевой среде, содержащей (г/л): глюкозу - 10 г/л, Na2HPO4·H 2O - 9.1, KH2PO4 - 1.5; MgSO 4·H2O - 0.2, Fe3C6 H5O7·7H2O - 0.25, NH 4Cl - 1.0. Стандартный раствор микроэлементов по Хоагланду из расчета 3 мл на 1 л питательной среды, который содержит: H 3BO3 - 0.228, СоСе2×6H2 O - 0.030, CuSO4×5H2O - 0.008, MnCe 2×4H2O - 0.008, ZnSO4×7H 2O - 0.176, NaMoO4×2H2O - 0.050, NiCe2 - 0.008 (г/л). Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1 л при коэффициенте заполнения 0.3-0.5 в термостатируемой качалке. Культивирование проводят в течение 16 ч при 30°C и pH 7.0.