Роль и функции белков

Рис.1.18. Этапы определения N-концевой аминокислоты методом Эдмана

Тиазолиновое производное аминокислоты избирательно экстрагируют органическим растворителем и превращают в более стабильное фенилтиогидантоиновое производное. Последнее можно идентифицировать сравнением с известными стандартами при проведении тонкослойной хроматографии, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии или газо-жидкостной хроматографии.Наиболее важным преимуществом расщепления по Эдману по сравнению с другими методами определения N-концевой аминокислоты является то, что, проводя повторно с одним и тем же пептидом эту процедуру, каждый раз можно идентифицировать новую N-концевую фенилгидантоин-аминокислоту, выясняя таким образом аминокислотную последовательность.

1.3.2Идентификация С-концевой аминокислоты. Один из подходов заключается в использовании ферментов - карбоксипептидаз (катализирует отщепление от пептида С-концевой аминокислоты). Карбоксипептидазы, подобно другим ферментам, обладают субстратной специфичностью, то есть они катализируют отщепление определенных аминокислот. Вместе с тем, наличие рядом с С-концевой аминокислотой остатка Про делает невозможной её отщепление под влиянием карбоксипептидазы. В этом случае наиболее надежным считается метод гидразинолиза. Полипептид обрабатывают безводным гидразином при температуре 900С в течение 20-100ч в присутствии ионообменного сорбента (в качестве катализатора). При этом разрушаются все пептидные связи, а из высвобождающихся аминокислот образуются гидразиды. Но С-концевая аминокислота высвобождается как свободная и поэтому её можно идентифицировать хроматографически. 

1.3.3 Определение аминокислотной последовательности.

Установление концевых аминокислот в исследуемом пептиде позволяет в дальнейшем определить всю его аминокислотную последовательность. Для этого обычно проводят повторное разрушение по Эдману в автоматическом приборе - секвенаторе, который был предложен П. Эдманом и Г. Бэгом. Современный такой прибор определяет 1 аминокислотный остаток в час. Таким способом можно установить последовательность расположения 40-60 остатков аминокислот. Затем накапливаются незавершенные реакции, продукты побочных реакций. Наряду с потерей самого пептида они делают малоинформативной и ненадежной дальнейшую идентификацию аминокислот. Чтобы установить последовательность их расположения в больших полипептидных молекулах, их подвергают расщеплению ферментативным или химическим путем на фрагменты с размерами, достаточными для проведения секвенирования (рис.1.19).

1.3.4 Исследование последовательности нуклеотидов ДНК - рутинная операция в молекулярной биологии. Этот метод в последнее время вытеснил другие методы исследования первичной структуры белков. Зная последовательность нуклеотидов, можно легко установить последовательность аминокислот

Метод пептидных карт. Процесс определения аминокислотной последовательности в белке - процедура достаточно длительная. Её можно существенно ускорить в случае выяснения аминокислотной последовательности гомологичного белка, если у сравниваемого белка она уже известна. Метод носит название "метод пептидных карт" или "метод отпечатков пальцев". Он включает в себя сочетание хроматографии и электрофореза на бумаге продуктов неполного гидролиза сравниваемых белков. При этом пептидные фрагменты, отличающиеся аминокислотной последовательностью, будут обладать разной подвижностью по сравнению с таковыми у исходного белка

 

 

1.4 Пространственная структура белковой молекулы

Самым лучшим методом, позволяющим выяснить расположение в трехмерном пространстве белковой молекулы, является рентгеноструктурный анализ кристаллов белка. Белок для этого должен быть очень чистым (гомогенным). Из него готовится насыщенный раствор (около 10 мг белка/мл), который выдерживается до образования в нем кристаллов. В кристалле белковые молекулы формируют очень правильную решетку. Такой кристалл помещают на пути пучка g-лучей. g-частицы, проходя через кристаллическую решетку, сталкиваются с атомами молекулы белка и изменяют свою траекторию. В результате возникает вторичное g-излучение, которое фиксируется на фотопластинке. Кристалл белка поворачивают на определенный угол и снова пропускают через него g-лучи. На фотопластинках с дифракционными картинами вторичного g-излучения измеряется расстояние между пятнами, а с помощью компьютера формируют карту электронной плотности. Затем специальным математическим методом, получившим название "трансформация Фурье", карту преобразуют в структурную модель белка.

Именно таким методом пользовались американские исследователи Л. Поллинг и Р. Кори, исследуя ди- и трипептиды. Из обнаруженных особенностей в строении пептидной связи вытекали три постулата или принципа, сформулированные Л.Поллингом и Р.Кори:

1. Атомы, образующие пептидную связь, копланарны (лежат в одной плоскости). Вращение атомов или групп атомов вокруг пептидной связи невозможно или чрезвычайно затруднено;
2. Принцип эвивалентности вклада аминокислотных остатков в образование пептидной связи и, тем самым, в образование полипептидной цепи (за исключением Про).

3. Принцип  максимума водородных связей. В  белках атомы водорода и кислорода  практически всегда располагаются  в транс-конформации. Это обусловливает возможность образования в полипептидной цепи максимума водородных связей Если пептидные связи "жесткие", плоскостные, то участки полипептидной цепи между Сa - С и N - Сa конформационно подвижны. В результате стремления боковых радикалов аминокислотных остатков выйти из заслонения формируется правозакрученная спиралевидная конформация полипептидной цепи

Вторичная структура белков

В 1950 г. Лайнус Полинг предложил два вида пространственной структуры белков - альфа-спираль и бета-структуру. Эти понятия сохранились до настоящего времени как виды вторичной структуры белков. Кроме них сейчас различают ещё один, третий тип вторичной структуры - b-поворот. Вторичная структура белка - это локальная конформация полипептидной цепи, обусловленная вращением отдельных участков этой полипептидной цепи вокруг одинарных ковалентных связей.

Стабильность спирали поддерживают водородные связи между атомами пептидных группировок аминокислот, расположенных на соседних витках спирали. Все условия, ведущие к формированию спиральных структур, могут успешно реализоваться и при другой форме расположения полипептидной цепи. Эту альтернативную спирали форму назвали β-структурой. Она формируется при укладке цепи в форме плоских шпилек. β-структура также стабилизирована водородными связями. Из двух или более b-структурных участков полипептидной цепи формируется b-слой. В грубом приближении она плоская и напоминает лист. Однако из-за того, что плоскости пептидных групп в каждом b-структурном участке наклонены поочередно в разные стороны относительно направления этого участка, плоский b-слой приобретает складчатую форму.

b-поворот или b-изгиб - ещё один тип вторичной структуры, встречающийся во многих глобулярных белках в тех местах, где направление полипептидной цепи меняется на противоположное. Данная структура часто рассматривается как связующее звено между двумя уложенными антипараллельно b-участками в составе b-слоя. Она образуется в полипептидной цепи там, где встречается пролин. Дело в том, что эта аминокислота не может изгибаться, и там где она встречается в полипептидной цепи, a-спираль и b-структура обычно нарушаются. В этом месте образуется своеобразный излом - b-поворот. В b-повороте водородная связь замыкается через три аминокислотных остатка. Там, где встречается b-поворот, полипептидная цепь делает изгиб. b-повороты обычно находятся у поверхности белковой молекулы.

Схематическое изображение b-структуры. а) параллельное, б) антипараллельное расположение b-структурных участков полипептидной цепи в b-слое

 

 

Третичная структура белков

  Третичной структурой белков назвали расположение в пространстве всей полипептидной цепи, отдельные участки которой имеют свою локальную конформацию, то есть сохраняют спиральные или b-структурные формы. Большая часть белков на уровне третичной структуры принимает глобулярную (шаровидную) форму. Это связано, с тем, что многие неполярные группы радикалов аминокислот под влиянием полярного растворителя, воды, объединяются между собой в кластеры, исключающие воду. При этом они разрывают водородные связи между диполями воды, уменьшая энтропию, и сближаются на расстояния, доступные для электростатического взаимодействия между ними. Такое взаимодействие получило название "сил гидрофобного взаимодействия". Эти силы, требующие небольших усилий для разрыва, тем не менее приобретают важнейшее значение для стабилизации пространственной структуры белка. Гидрофобные радикалы оказываются внутри белковой молекулы, а гидрофильные - наружи, тем самым снижение энтропии становится минимальным.

Рис.1.30. Этапы пространственной укладки полипептидной цепи и приобретения ею третичной структуры

 

Важную роль в стабилизации третичной структуры белка играют водородные связи и ионное взаимодействие . Указанные силы успешно сочетают прочность структуры белка и ее довольно значительную подвижность, что чрезвычайно важно для выполнения функций. В ряде белков прочность структуры укрепляется дополнительно и ковалентными дисульфидными связями.

Рис.1.31. Связи, стабилизирующие третичную структуру белка. А. Ионная связь. Б. Водородная связь   (три типа показаны). В. Гидрофобное взаимодействие (две формы - нижнее кластерного типа, а верхнее типа p-связи). Г. Дисульфидная связь.

 

В фибриллярных (нитевидных) белках третичная структура формируется или путем многослойной укладки плоских b-структур, или параллельной укладкой нескольких спиральных структур. В любом случае возникают ориентированные в длину волокнистые структуры. Такие волокна имеют высокую прочность. Примером такого белка может служить белок соединительной ткани - коллаген. Его молекула представляет своеобразную суперспираль, состоящую из 3-х спирально свернутых полипептидных цепей. Такие суперспирали, в свою очередь, укладываются в форме более толстых протофибрилл, объединяемых затем в коллагеновое волокно.

Уникальному пространственному расположению атомов в молекуле белка (укладка полипептидной цепи в пространстве), которое "запрограммированно" самой аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и поэтому образуется самопроизвольно, нужны помощники. Эти помощники также являются белками и получили название "шапероны". Впервые они были открыты как "белки теплового шока". Их функция заключается в защите складывающейся полипептидной цепи от взаимодействия с другими многочисленными клеточными белками и, возможно, в ускорении этого процесса.

Четвертичная структура белков

Под четвертичной структурой понимают структуру белков, состоящих из нескольких полипептидных цепей. Каждая из этих цепей имеет свою завершенную пространственную структуру и называется субъединицей белка с четвертичной структурой. Белок при таком объединении нескольких цепей приобретает новую функцию.

 

 Рис.1.32. Уровни структурной организации  белковой молекулы

 

Связи, которые имеются между субъединицами, как правило, нековалентные (силы гидрофобного взаимодействия, ионные, водородные), хотя в ряде белков (например, белки плазмы крови) субъединицы соединены ковалентными дисульфидными мостиками. Создание белков с четвертичной структурной организацией позволило Природе расширить свои возможности в области качественного разнообразия белков при незначительном увеличении количества генетического материала. Например, фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ), состоящий из 4-х субъединиц, формируется из 2-х генетически детерминированных полипептидных цепей H и M. Их разные комбинации (HHHH,HHHM,HHMM,HMMM,MMMM) позволяют существовать в организме 5 ферментам ЛДГ, катализирующих одинаковую реакцию в разных органах и тканях. Такие белки с одинаковыми функциями, но отличающимися физико-химическими свойствами получили название изопротеинов.

Слабое взаимодействие между отдельными частями белкой молекулы дает ей некоторую свободу к изменениям пространственной структуры. Расположение атомов или групп атомов молекулы органического вещества, обусловленное возможностями вращения их вокруг ковалентных связей, получило название конформации. Изменение конформации белковой молекулы лежит в основе ее биологической активности.

 

 

 

 

 

Список литературы

 

• Источник: http://meduniver.com/Medical/Physiology/181.html MedUniver

 

• Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 3-4, 7-40.

 

• д.м.н., проф. Грицук Лекции по биологической химии